The influence of palmitoylation on protein interaction: Investigating monoamine neurotransmitter transporters with molecular dynamics simulations

Abstract

Monoamin Neurotransmitter Transporter (MATs) prägen die synaptische Signalübertragung, indem sie Dopamin, Noradrenalin und Serotonin aus dem extrazellulären Raum entfernen. Palmitoylierung kann die MAT-Funktion modulieren, unter anderem durch eine erhöhte Transportkapazität des Dopamintransporters (DAT). Zudem wurden MATs als Dimere und Oligomere beschrieben. Ein möglicher Zusammenhang ergibt sich daraus, dass die Haupt-Palmitoylierungsstelle des DAT in unmittelbarer Nähe von TM12 liegt, einer Transmembranhelix, die wiederholt als Bestandteil von MAT-Dimerinterfaces beschrieben wurde. Diese Arbeit untersucht, ob Palmitoylierung die Dimerisierung und Interface-Präferenzen des Noradrenalintransporters (NET) und des DAT verändert und wie die Membranzusammensetzung diese Effekte beeinflusst. Dazu wurden coarse-grained Molecular Dynamics MARTINI3 Simulationen von palmitoylierten und nicht-palmitoylierten NET- und DAT-Dimeren durchgeführt, ausgehend von einer durch Kryoelektronenmikroskopie (cryo-EM) entdeckten NET-Dimergeometrie in mehreren Membranmodellen. Die Dimerstabilität und Interfaces wurden mittels RMSD, 2DAufenthaltsdichtekarten, Analyse von Helix-Helix-Kontakten transmembraner Segmente sowie Lipidkontakt-Statistiken in der Nähe der Palmitoylierungsregion quantifiziert.Die cryo-EM-abgeleitete Dimeranordnung war nach Aufhebung der Restraints in allen Membranmodellen instabil, was darauf hinweist, dass diese Geometrie im vorliegenden coarse-grained Setup nicht begünstigt ist. Stattdessen bildeten sich reproduzierbar alternative metastabile Dimere, deren Interfaces durch die Scaffold-Domänen-Helices und insbesondere TM12 gebildet wurden. Palmitoylierung stabilisierte die Dimere nicht generell, verschob jedoch die Verteilung der Interface-Populationen. TM12-beteiligte Interfaces nahmen bei NET zu und wurden über Replikate hinweg häufig reproduzierbarer, während DAT nach Palmitoylierung gegenteilige TM12-assoziierte Trends und eine erhöhte Variabilität zeigte. Insgesamt stützen die Ergebnisse die Auffassung, dass die MAT-Dimerisierung ein Ensemble membranabhängiger Interface-Zustände darstellt, welche durch Palmitoylierung umgeformt werden kann, anstatt in einer einzelnen, stabilen Dimergeometrie vorzuliegen.

Monoamine neurotransmitter transporters (MATs) shape synaptic signaling by clearing dopamine, norepinephrine, and serotonin from the extracellular space. Palmitoylation can modulate MAT function, including an increased transport capacity of the dopamine transporter (DAT). In parallel, MATs have been reported to form dimers and oligomers. A potential mechanistic link is suggested by the major DAT palmitoylation site being proximal to TM12, a transmembrane helix that has been repeatedly described in MAT dimer interfaces. This thesis tests whether palmitoylation alters dimerization and interface preferences of the norepinephrine transporter (NET) and DAT, and how membrane composition modulates these effects. Coarse-grained MARTINI3 molecular dynamics simulations of palmitoylated and non-palmitoylated NET and DAT dimers were initiated from a cryo electron microscopy (cryo-EM) derived NET-dimer geometry across multiple membrane models. Dimer stability and interfaces were quantified using RMSD, 2D occupancy density maps, transmembrane helix-helix contact analysis, and lipidcontact statistics near the palmitoylation region.The cryo-EM-derived dimer arrangement was unstable after release of restraints in all membrane models, indicating this geometry is not favorable within the present coarse-grained setup. Alternative metastable dimers reproducibly formed, with interfaces enriched in scaffold-domain helices and especially TM12. Palmitoylation did not generically stabilize the dimers but shifted the interface populations. TM12-involving interfaces increased for NET and often became more reproducible across replicas, whereas DAT showed opposite TM12-associated trends and increased variability upon palmitoylation. Overall, the results support MAT dimerization as an ensemble of membrane-dependent interface states that can be reshaped by palmitoylation rather than stabilized into a single dominant dimer.