Development and application of analytical methods for the determination of fungal bioactive compounds using liquid chromatography - high resolution mass spectrometry

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurden moderne, analytische Methoden wie die Flüssigchromatographie gekoppelt an hochauflösende (Tandem-) Massenspektrometrie (Liquid Chromatography - High Resolution (tandem) mass spectrometry, LC-HRMS(/MS)) zur Detektion und Charakterisierung fungaler Sekundärmetaboliten verwendet. Ziel war es komplexe biologische Interaktionen zu untersuchen wie es für Metabolom-Studien erforderlich ist. Dabei wurden analytische Methoden für den gezielten quantitativen Nachweis ausgewählter Substanzen, gerichtete Screening-Ansätze und ungerichtete Screening-Ansätze entwickelt und angewendet.<br />Für die Identifizierung bioaktiver Substanzen gegen das Pflanzenpathogen Fusarium graminearum wurde ein Bioassay-geleitetes Arbeitsschema entwickelt. Die Konzepttauglichkeit wurde für fungale Kulturüberstände gezeigt. Ergebnisse der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Anwendungen umfassten die Substanzen Verrucarin A und Mycophenolsäure.<br />Obwohl diese Substanzen aufgrund ihrer Toxizität nicht als neuartige Pflanzenschutzmittel gegen Fusarium in Frage kommen zeigen diese Ergebnisse die generelle Anwendbarkeit des entwickelten Arbeitsschemas.<br />Darüber hinaus wurde eine klassische gerichtete Analysenmethode für die Quantifizierung 20 ausgewählter Mykotoxine entwickelt. Im Rahmen einer In-house Validierung wurden für die gesetzlich geregelten Mykotoxine Präzision, Richtigkeit, Nachweisgrenze und Matrixeffekte für die Matrix Mais ermittelt. Zusätzlich wurde eine Screening-Methode mittels retrospektiver Datenanalyse für 208 fungale Metaboliten erstellt. Diese Methode wurde auf Referenzmaterialien angewendet und führte zum positiven Nachweis von 13 Substanzen, die in den untersuchten Referenzmaterialen zusätzlich zu den Ziel-Analyten enthalten waren.<br />Die Detektion und Identifizierung Eisen-haltiger Metaboliten (Siderophore) wurde durch die Entwicklung und Anwendung eines Stabilisotopen-basierten Screening-Arbeitsschemas erreicht. Zuerst wurde eine Datenbank mit 422 bekannten mikrobiellen Siderophoren aufgebaut und eine Liste gebräuchlicher Masseninkremente, die typisch für Siderophor-MS/MS Spektren sind, erstellt. Diese Methode wurde auf Kulturüberstände von zehn Trichoderma-Stämmen angewendet. Dadurch konnten vier Siderophore identifiziert, vier annotiert und mindestens zehn neuartige Hydroxamat-Siderophore gefunden werden. Zusätzlich wurde diese Methode erfolgreich auf NRPS-knockout Stämme von Trichoderma virens angewendet.<br />Die Substanzidentifizierung unbekannter Metaboliten stellt immer noch eine große analytische Herausforderung dar. Daher wurde die Markierung mit stabilen Isotopen zur Erleichterung der Auswertung von Tandem-MS-Experimenten anhand ausgewählter Standardverbindungen (natürlich und 13C-markiert) verwendet. Zusätzlich wurde die Datenauswertung deutlich durch einen neu entwickelten Software-Algorithmus erleichtert. Dieser dient zur automatisierten Bestimmung der Anzahl an Kohlenstoff-Atomen in MS/MS Fragmentspektren der natürlichen und markierten MS Signale. Zusätzlich werden Elementzusammensetzungen der zugehörigen Fragmentionen vorgeschlagen. Es konnte gezeigt werden dass dadurch die Datenbearbeitungszeit deutlich reduziert wird und sinnvolle Summenformeln zu den zugehörigen akkuraten Tandem MS Signalen erzeugt werden. Daher zeigt dieser Ansatz hohes Potential um in zukünftigen Metabolomics-Studien eingesetzt zu werden um die Strukturaufklärung unbekannter Verbindungen, die möglicherweise eine entscheidende biologische Rolle für Organismen spielen, voranzutreiben.<br />

Within this thesis, modern analytical approaches such as liquid chromatography coupled to high resolution (tandem) mass spectrometry (LC-HRMS(/MS)) were used to study metabolites involved in complex biological interactions as is required for metabolomics studies. Those include targeted analytics, targeted screening approaches and non-targeted screening approaches. For the elucidation of bioactive compounds, a bioassay-guided workflow was established. In a proof-of-principle study this workflow was successfully applied to fungal culture supernatants and resulted in the identification of verrucarin A and mycophenolic acid as bioactive compounds against Fusarium. Although these substances are not suited for the use as novel plant protectants due to their toxicity these results showed the general applicability of the established workflow. Regarding targeted analytics, a method for the quantification of 20 selected mycotoxins was established and method performance characteristics (precision, trueness, limit of detection, matrix effects) for regulated mycotoxins were evaluated for the matrix maize.<br />Additionally, a screening approach for 208 fungal metabolites was proposed by retrospective data analysis. The screening was applied to the reference materials and led to the putative detection of 13 further metabolites in addition to the target toxins. Detection and identification of iron-containing metabolites (siderophores) was accomplished by establishing a stable isotope-assisted screening workflow. First, a database containing 422 known microbial siderophores and a list of common siderophore neutral losses, typically present in siderophore MS/MS spectra, was established.<br />The method was applied to culture supernatants of ten different Trichoderma strains. In total, four siderophores were identified, four were annotated and at least ten putative novel hydroxamate-type siderophores were found. The established method has additionally been successfully applied to NRPS-knockout mutants of Trichoderma virens.<br />As identification of unknowns still is a major bottleneck in non-targeted LC-HRMS approaches, stable isotopic labeling (SIL) was used to facilitate the data evaluation of tandem MS spectra. In this respect, standard compounds (both native and 13C labeled were measured).<br />Additionally, data evaluation was greatly facilitated by a newly developed software algorithm which helps in the automated determination of the number of carbon atoms present in MS/MS fragment spectra of the native and the labeled compound. It also suggests elemental compositions to the respective fragment ions. It was shown that using this approach, data processing time is reduced and meaningful elemental formulas corresponding to accurate tandem MS signals are generated. Therefore, it shows high potential to be used in future metabolomics studies regarding the structure elucidation of unknown compounds which might play a significant biological role for organisms of interest.