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dc.contributor.advisorMihovilovic, Marko D.-
dc.contributor.authorFeroz, Saima-
dc.date.accessioned2020-06-30T06:29:49Z-
dc.date.issued2013-
dc.date.submitted2013-03-
dc.identifier.urihttps://resolver.obvsg.at/urn:nbn:at:at-ubtuw:1-58521-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.12708/10960-
dc.descriptionZsfassung in dt. Sprache-
dc.description.abstractBaeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMOs) sind bekannte und sehr vielseitige Katalysatoren für die Oxidation von Ketonen zu Estern oder Lactonen. Diese Enzymklasse zeichnet sich durch ihr großes Substratspektrum und die Fähigkeit sowohl aliphatische als auch zyklische Ketone stereo-, regio- und chemoselektiv umzuwandeln. Die so erhaltenen chiralen Produkte stellen besonders interessante Schlüsselbausteine in der Synthese biologisch aktiver Verbindungen und einiger Naturstoffe dar. Trotz dieser Eigenschaft, ist es bis jetzt nicht gelungen diese Enzymklasse industriell attraktiv zu machen. Die Gründe dafür liegen unter anderem an der geringen Stabilität und der teuren Redox-Cofaktor Abhängigkeit. Das Hauptziel dieser Arbeit war das Design und die Herstellung (thermo-)stabiler BVMOs für die industrielle Synthese. Ausgangspunkt dieser Studie war das Enzym Cyclohexanon Monooxygenase, welches aus Acinetobacter (NCIB 9871; CHMOAcineto) stammt. Durch das Einführen gezielter Punktmutationen in die helicalen Strukturelemente, welche durch den Sequenzvergleich (Konsensus-Ansatz) mit einer bekannten thermostabilen BVMO (PAMO) stammen, sollte die Thermostabilität untersucht und verbessert werden. Dabei wurden verschiedene kombinatorische und rationale Ansätze verfolgt, welche zu mehreren Generationen an Mutanten geführt haben. Um die katalytische und thermische Performance zu untersuchen wurden die Enzyme mit einem eigens zu diesem Zweck entwickelten Testverfahren sowohl im "Ganz-Zell"-System also auch im Zellextrakt im Parallelformat getestet. Aktive und stabilere Mutanten wurden in weiterer Folge einem ausführlichen Substratakzeptanztest unterzogen, um einen Einfluss der genetischen Veränderungen auf die Stereoselektivität zu untersuchen. Genauere Untersuchungen der Mutanten mittels sogenannter ThermoFAD-Experiemte haben gezeigt, dass BVMOs zwei natürliche aktive Formen N1 und N2 besitzen, die bei weiterer thermischer Belastung in einen dritten ungefaltenen Zustand U übergeführt werden können. Dieser noch aktive Übergangszustand verliert seine katalytischen Fähigkeiten, wenn die Denaturierungsbedingungen beibehalten werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Lagerstabilität der erzeugten Mutanten bei 30°C von 80 Stunden (Wildtyp) auf fast das Zehnfache (722 Stunden) verbessert werden konnte. Wie bereits aus der Literatur bekannt (Reetz et al.) konnte die Substratakzeptanz von sterisch anspruchsvollen Ketonen mittels gerichteter Evolution von CHMOAcineto an der Position 432 erweitert werden. Durch Einführung weiterer Mutationen an der oben genannten Stelle (F432S, F432I) in die temperaturstabilsten Enzymmutanten (S2) konnte neben einer höheren Temperaturstabilität auch noch eine erweiterte Substratakzeptanz beobachtet werden. Der kinetisch stabile Mutant S2 war flexibel genug um weitere Mutationen zu tolerieren, ohne dabei an Aktivität und Selektivität zu verlieren.<br />Zusammenfassend kann man sagen, dass der in dieser Arbeit gewählte sogenannte Konsensus-Ansatz ein sehr generell anwendbares Konzept darstellt um die thermischen Eigenschaften von Biokatalysatoren (in diesem Fall zum ersten Mal an Flavin-Monooxygenasen) zu verbessern. Mit dieser Arbeit ist es gelungen der industriellen Anwendbarkeit der Baeyer-Villiger Monooxygenasen einen Schritt näher zu kommen und BVMOs im Allgemeinen einmal mehr als nützliches Tool für synthetische Applikationen zu präsentieren.<br />de
dc.description.abstractBaeyer-Villiger monooxygenases (BVMO's) were recognized as highly versatile biocatalysts for oxygenation of ketones to esters or lactones. A prominent transformation of such enzymes is the stereoselective oxidation of cyclic and/or aliphatic ketones to chiral lactones/esters which are interesting building blocks for the synthesis of bioactive and natural compounds. However, due to number of reasons, large-scale application was not enforced on a satisfactory level, so far. This project aims at overcoming the last major obstacle en route to readily applicable BVMOs in every day synthetic applications by designing novel thermostable enzymes. Cyclohexanone monooxygenase (CHMO) originating from Acinetobacter NCIB 9871 was chosen for this study. Mutations to stabilize helical structure motifs in particular were predicted by sequence comparison with the structure of phenylacetone monooxygenase (PAMO) from Thermobifida which was recently established by X-ray diffraction. Certain combinatorial and rational protein design approaches were applied for the development of several generations of mutants. Parallel screening methods both on whole-cells as well as crude cell extracts were utilized to assess biocatalytic performance. These mutants were screened for their thermostability according to the protocols established for this study.<br />Selected thermally and kinetically stable mutants were screened with a number of already known substrates to check whether selectivity and specificity of enzyme were retained throughout the process of mutations.<br />ThermoFAD experiments indicated the presence of two native active stages N1 and N2 of enzyme which is followed by unfolded stage (U) and then deactivated (D) form, if the denaturing condition stays. Shelf life of mutant enzymes at 30°C can be improved from 80 hours (WT) to 722 hours (mutant). An increase of more than 1400 % in the yield during the life time of enzyme, over the wild type is achieved. Expanded substrate acceptance to facilitate biotransformation of sterically demanding ketones was observed after directed evolution of CHMOAcineto wild type at position 432 by Reetz et. al. One core mutation at position 432 (F432S and F432I) was introduced in the most stable mutant S2 to check whether our mutant still retains the property. The results obtained after the screenings showed that our kinetically stable mutant still has the flexibility of increasing the substrate scope by adding more mutations. In summary, the generality of the consensus based approach for the improvement of thermal stability of biocatalysts could be successfully applied to a flavin monooxygenase for the first time. We conclude that this study constitutes a step forward in the engineering of practical Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) for further applications in synthetic organic chemistry and biotechnology.en
dc.format251 Bl.-
dc.languageEnglish-
dc.language.isoen-
dc.subjectBaeyer Villigerde
dc.subjectBiokatalysede
dc.subjectMonooxygenasede
dc.subjectthermostabilde
dc.subjectBaeyer Villigeren
dc.subjectbiocatalysisen
dc.subjectmonoogxygenaseen
dc.subjectthermostableen
dc.titleImproving the thermostability of Baeyer Villiger monooxygenasesen
dc.typeThesisen
dc.typeHochschulschriftde
dc.contributor.assistantMach, Robert-
tuw.publication.orgunitE163 - Institut für Angewandte Synthesechemie-
dc.type.qualificationlevelDoctoral-
dc.identifier.libraryidAC07815365-
dc.description.numberOfPages251-
dc.identifier.urnurn:nbn:at:at-ubtuw:1-58521-
dc.thesistypeDissertationde
dc.thesistypeDissertationen
item.fulltextwith Fulltext-
item.openairetypeThesis-
item.openairetypeHochschulschrift-
item.cerifentitytypePublications-
item.cerifentitytypePublications-
item.languageiso639-1en-
item.grantfulltextopen-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
item.openairecristypehttp://purl.org/coar/resource_type/c_18cf-
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