Engineering an N-acetylneuraminic acid synthesis pathway into Hypocrea (Trichoderma)

Abstract

In dieser Arbeit wird ein neuer biochemischer Syntheseweg vorgestellt, der auf dem filamentösen Pilz Hypocrea jecorina (anamorph:<br />Trichoderma reesei) basiert. Aufgrund der massiven Sekretion von hydrolytischen Enzymen besitzt dieser Pilz die Fähigkeit Biopolymere wie Cellulose aber auch Chitin in ihre Monomere abzubauen und zu metabolisieren. Da das Monomer von Chitin, N-Acetyl-D-Glukosamin, ein Substrat für die Synthese von N-Acetyl-D-Neuraminsäure (NeuNAc) darstellt und Chitin ein günstiger erneuerbarer Rohstoff ist, soll dieser Pilz zur Produktion von NeuNAc eingesetzt werden. H. jecorina weist aber keinen bekannten Stoffwechselweg zur Herstellung von NeuNAc auf. Deswegen soll ein künstlicher Stoffwechselweg durch heterologe Proteinexpression eingeführt werden. Zwei bakterielle Gene kodierend für eine N-Acetylglukosamin-2-epimerase und eine NeuNAc-Synthase werden in das Genom von H. jecorina eingeführt. Um die methodischen Voraussetzungen für diese Arbeit zu schaffen, wird in dieser Arbeit eine Transformationsstrategie von H. jecorina vorgestellt, die das zielgerichtete Einbringen oder Deletieren von Genen im Pilzgenom erlaubt und zudem Selektionsmarker rückgewinnt. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit behandelt die Messung von mRNA mittels quantitativer PCR, die ein unerlässliches Werkzeug zur genetischen Analyse darstellt. Für die Messung ist eine Normalisierung auf ein stabil transkribiertes Gen notwendig. In dieser Arbeit wird die Evaluation stabiler Gene für H.<br />jecorina durchgeführt. Diese Dissertation belegt, dass ein künstlicher Stoffwechselweg zur Herstellung von NeuNAc in H. jecorina eingefügt werden kann und in vivo funktionstüchtig ist.<br />

In this work a new biochemical synthesis pathway is presented, which is based on the filamentous fungus Hypocrea jecorina (anamorph:<br />Trichoderma reesei). This fungus is known for its high secretory capacity of hydrolytic enzymes. Therefore, this fungus is able to hydrolyze biopolymers like cellulose or chitin into their monomers.<br />Chitin is a cheap and renewable feed stock and its monomer, N-acetyl-d- glucosamine, is used as a substrate for the synthesis of N-Acetyl-D-neuraminic acid (NeuNAc). In this PhD H. jecorina is used as production host for NeuNAc. Natural occurring H. jecorina strains do not produce NeuNac and therefore a synthetic pathway is introduced into this fungus by heterologous protein expression. Two bacterial genes, encoding an N-Acetylglucosamine-2-epimerases and a NeuNAc synthase are introduced into the genome of H. jecorina. In order to achieve this goal, this work presents a new transformation strategy which allows the targeted transformation of this fungus and full marker recycling. Furthermore, a normalization strategy for reference genes is presented, which is necessary to accurately measure mRNA levels using RT-qPCR. This PhD thesis demonstrates that a synthetic biochemical pathway can be introduced into H. jecorina and is fully functional in vivo.