Establishment of a proteomic workflow for biomarker research in blood cell samples

Abstract

Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung eines Arbeitsablaufs für die Biomarker-Suche im Proteom von Blutzellen. Dazu wurden die Proteine der Zellen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt, quantifiziert und jene Proteine, die zwischen den betrachteten Gruppen Unterschiede hinsichtlich ihres Expressionsverhaltens zeigten, mittels matrix-assisted laser desorption/ionisation (MALDI) Massenspektrometrie identifiziert. Um eine gute und möglichst reproduzierbare Auftrennung der Proteine mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese zu erzielen, ist eine Optimierung der Proben¬vorbereitung unerlässlich. Dazu wurde die generelle Tauglichkeit verschiedener Fällungsreagenzien und die Auswirkung ihrer Anwendung auf das Ergebnis der 2D-Elektrophorese untersucht, wobei sich die Verwendung von Trichloressigsäure als Fällungsmittel am besten bewährt hat. Um eine Abschätzung der zu erwartenden Veränderungen am Proteom zu erhalten und die Proteinidentifizierung mittels Massenspektrometrie zu optimieren, wurde eine bereits bestehende Versuchsanordnung zur Analyse der Veränderungen am Proteom von U937-Zellen (eine monocytische Zelllinie) bei Glutamin-Mangel benutzt. Die in den vorangegangen Experimenten gewonnenen Erfahrungen wurden auf die Analyse primärer Zellen, Thrombocyten, übertragen. Um eine Biomarkersuche in Thrombocyten planen zu können, ist es notwendig Kenntnis der zwischen Proben von Individuen zu erwartenden Schwankungen hinsichtlich der Proteinexpression zu haben. Dazu wurden die Protein-Extrakte von Thrombocyten von 20 Freiwilligen analysiert und die Schwankung in den Konzentrationen der aufgetrennten Proteine innerhalb dieses Kollektivs bestimmt. Das Ausmaß dieser Schwankungen wurde dazu benutzt, die zumindest notwendige Probandenzahl abzuschätzen, mit der sich statistische Signifikanz für einen bestimmten Expressionsunterschied zwischen Gruppen von Individuen ergibt. Proteine, die besonders geringe Schwankungen aufweisen, wurden identifiziert und könnten in weiterer Folge für Normalisierungen bei anderen Methoden eingesetzt werden. Aufbauend auf diese Erkenntnisse lässt sich eine Biomarker-Suche in Blutzellen, insbesondere Thrombocyten ohne weitere Vorversuche durchführen.<br />

The aim of this PhD-Thesis was the development of a workflow, suitable for biomarker search within the proteome of blood cells.<br />Cellular proteins were separated by two-dimensional gel electrophoresis, quantified and those proteins, which showed different expression levels between the considered groups, were identified by matrix-assisted laser desorption/ionisation (MALDI) mass spectrometry. To achieve good and reproducible separation of the proteins by two-dimensional gel electrophoresis, an optimisation of the sample preparation steps was necessary. Therefore, the applicability of different precipitation agents and their compatibility to 2D electrophoresis was tested, whereas trichloroacetic acid has shown to be superior. To get an estimation of the expression changes, that have to be expected and to optimise protein identification workflow based on by mass spectrometry, an already established experimental setup for the analysis of the changes in the proteome of U937 cells (monocytic cell line), that were challenged by glutamine starvation, was used. The experiences that have been gained during the preliminary experiments were applied to the analysis of primary cells, thrombocytes. To design a search for biomarkers in thrombocytes, it is necessary to assess the amount of variability in protein expression levels between samples of different individuals. Therefore, the thrombocyte protein extracts, obtained from 20 volunteers, were analysed and the variation in protein expression levels within this group was determined. This degree of variation was used to estimate the minimum number of samples, that is needed to obtain statistical significance for a given difference in expression levels when comparing two groups of individuals. Some proteins showed very low variation and were identified by mass spectrometry. These proteins and can serve for normalisation purposes in different methods. Taking into account these results we are now able to define the technical procedure to perform a biomarker search in blood cells without further experiments.