Characterization of proteins, viruses, nano silica particles, non-covalent complexes and dendrimers by means of Gas Phase Electrophoretic Macromolecule Mobility Analysis (GEMMA) and Parallel Differential Mobility Analysis (PDMA)

Abstract

Elektrostatische differentielle Mobilitätsanalyse (DMA) ist eine sich in den letzten Jahren stark weiterentwickelnde Methode für die Analyse von geladenen Partikeln/Molekülen im luftgetragenen Zustand. In Kombination mit einer nano-Elektrospray-Aerosol Quelle ist diese Methode geeignet, suspendierte anorganische Partikel und Biopolymere wie Proteine oder DNA ab etwa einer Größe von einem Nanometer zu analysieren. Die Voraussetzung für DMA ist ein definierter Ladungszustand der Partikel. Die Effizienz der konventionellen Methode, welche diesen Zustand mittels Diffusion von mit radioaktive Quellen (z.b. Po210) erzeugten bipolarer Ionen erreicht, ist in diesem Größenbereich sehr gering (<1%). Es wurde daher ein neuartiges, auf Korona-Entladung basierendes Gerät zum elektrostatischen Aufladen von Nanopartikel implementiert und charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass diese Methode eine bis zu vierfach höhere Effizienz im Erzeugen von einfach geladenen Nanopartikeln besitzt. Die Anzahl der verfügbaren DMA Instrumente, die im Nanometerbereich einsetzbar sind, steigt stetig. Es wurde daher die Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit von elektrophoretischen Mobilitätsspektren mehrerer nano-DMA Systeme mittels globulärer Proteine mit Größen unterhalb von 15 nm (Molekulargewicht ca. 1 MegaDa) untersucht. Dabei konnte einerseits eine hohe Präzision (~0,1% Schwankung während einer Messserie auf einem Gerät) auf individuellen Instrumenten, aber auch eine Streuung (bis zu 15% Unterschied zwischen verschiedenen Geräten) beobachtet werden, was die Notwendigkeit einer Kalibration der Messysteme aufzeigt.<br />Als mögliche Kalibranden wurden Dendrimere (globuläre, durch ihre Herstellungsmethode gut definierte Polymere mit proteinartigen Eigenschaften) von 3 bis 15 nm Größe im DMA untersucht. Die bestimmten Partikelgrößen waren dabei nahezu ident, mit in der Literatur beschriebenen Werten welche mit Elektronenmikroskopie, Atomic Force Mikroskopie, Röntgen- und Neutronenstreuung erhalten wurden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Versuchsaufbau sowohl zerstörungsfreie Messungen von Komplexen mit nicht-kovalenter Bindungen als auch eine Analyse im hohen Massenbereich ermöglicht. Somit konnte eine mit anderen Methoden schwer zugängliche nichtkovalente Bindung von Antikörpern an ein Virususpartikel nachgeweisen werden. Dazu wurde ein humanes Rhinovirus (HRV) in verschiedenen Konzentrationen mit spezifischen Antikörpern inkubiert. Die dabei gemessene Größenänderung des Viruspartikels war Ausgangspunkt der Berechnung der maximalen Anzahl gebundener Antikörpermoleküle, welche 28 ± 4 biospezifisch gebundene Antikörper betragen hat. Dieser Wert ist praktisch identisch mit dem theoretischen Wert, der sich aus der Symmetrie des Virus und der Bindungsstellen des Antikörpers ergibt.<br />Die Zerstörungsfreiheit der DMA Methode, welche auch noch unter Normaldruck funktioniert, ermöglicht auch ihren mikropräparativen Einsatz um etwa Virusapartikel oder anorganische Nanopartikel aufzutrennen und größenselektiv anzureichern. Ein sogenannter Parallel-DMA (PDMA) kombiniert mit einer elektrostatischen Sammeleinheit wurde für diesen Zweck im Rahmen dieser Dissertation konstruiert und gebaut. Es wurden Nanosilikapartikel bestimmter Größe mit Hilfe dieses Versuchausbaus auf mikroskopischen Gittern gesammelt. Eine elektronenmikroskopische Untersuchung, der so gesammelten Partikelfraktionen, hat die Einsetzbarkeit der PDMA Methode für mikropräparative Zwecke bestätigt.<br />

Electrophoretic differential mobility analysis (DMA) is a method for the characterisation of charged, airborne particles/molecules. DMA is suited for the analysis of suspended inorganic particles as well as biopolymers such as DNA and proteins in combination with a electrospray aerosol generation beginning at approximately 1 nanometer in diameter.<br />For DMA, a defined charge state of the nanoparticles is required. The efficiency of the conventional method, which accomplishes this charge state by diffusion of bipolar ions produced by radioactive sources (e.g.<br />Po210) , is very low (>1%). A new, corona discharge based device for their replacement was implemented and characterized and showed a four times higher efficiency in the production of charged nanoparticles compared to conventional charging devices.<br />The number of available DMA systems designed for the nm size range increases continuously This fact rises question about reproducibility and comparability of electrophoretic size spectra obtained with different nano-DMA systems. For this reason globular proteins in the size range below 15 nm (molecular weight of appr. 1 MegaDa) were applied on various DMA instruments. Results show on one hand a high precision (~0.1% variation within an experimental series) of individual instruments, but also high variation (up to 15%) of the results acquired with different DMA systems, indicating the necessity of harmonized calibration of DMA instruments. As possible calibrants, dendrimers (synthetic, well defined polymers with protein like properties) in a size range between 3 and 15 nm were investigated. Excellent agreement between DMA obtained particle sizes and values found in literature obtained with Transmission Electron Microscopy (TEM), Atomic Force Microscopy X-Ray scattering and Neutron scattering was observed, suggesting their suitability as size standards.<br /> It could be demonstrated that the used experimental setup offers preservation of non-covalent bonds and analysis of high molecular weights. These characteristics of DMA enabled the observation of the non-covalent attachment of specific binding antibodies to a virus surface, which is difficult to achieve with other analytical methods.<br />For this purpose, a human rhinovirus (HRV) was incubated with varying concentrations of a specific antibody. The observed size shift of the virus particle caused by attaching antibody molecules enabled the calculation of their number, with 28 ± 4 biospecific bound antibodies per virus particle, which is practically identical to the theoretical value which is determined by virus symmetry and position of antibody binding sites.<br />As DMA operates under atmospheric pressure and particles remain intact after analysis, this method offers opportunity for its micro-preparative application, enabling isolation and size selective sampling of for example Virus particles or inorganic nanoparticles. Based on this reasoning, a Parallel-DMA (PDMA) and an electrostatic sampler were specially designed and constructed within this PhD thesis. For feasibility tests, nanometer sized silica particles were applied this experimental setup and collected on a microscopic grid. Transmission electron microscopic analysis of the sampled nano-silica particle fractions confirmed the selectivity and the feasibility of the PDMA setup for micro-preparative purposes.<br />