Molecular characterization of initial steps in carbohydrate metabolism in Hypocrea jecorina and their role in cellulase induction

Abstract

Sugar kinases play a central role in carbohydrate metabolism, since they phosphorylate sugars after uptake in order to trap them inside the cell and prepare them for further catabolism. The pyrenomycetous ascomycete Hypocrea jecorina features amongst other sugar kinases one galactokinase (gal1), one hexokinase (hxk1) and one glucokinase (glk1). The role of these enzymes in carbohydrate metabolism and signalling was investigated. The single galactokinase of H. jecorina is responsible for the first step of the Leloir pathway, the phosphorylation of D-galactose to D-galactose 1-phosphate. Induction of the other genes of the Leloir pathway is independent from the H.<br />jecorina GAL1, which is in contrast to the situation in yeasts such as Saccharomyces cerevisiae or Kluyveromyces lactis, where the galactokinase acts as a regulatory protein and activates the transcription of the GAL pathway in the presence of D-galactose. We could show that galactokinase activity, but not the GAL1 protein itself is essential for induction of cellulases on lactose by replacing the H.<br />jecorina GAL1 with the Escherichia coli galactokinase. Additionally we present evidence for the existence of a second D-galactose degrading pathway which proceeds via reduction ofD-galactose to galactitol. The enzyme responsible for the second step in this pathway was identified as the L-arabinitol 4-dehydrogenase (lad1), since a [Delta]gal1[Delta]lad1 strain was unable to grow on galactitol or D-galactose as carbon source.<br />To facilitate successive gene knock-outs in H. jecorina we applied a blaster cassette approach. This cassette consisting of the H. jecorina pyr4 gene flanked by two direct repeats was used to delete the single hexokinase and glucokinase in H. jecorina. The cassette was removed after deletion of the glucokinase encoding gene to construct a strain deleted in both hexo- and glucokinase. Strains deleted in both genes were unable to grow on D-glucose and also showed a defect on a number of other carbon source. Using three genetic systems, diagnostic for carbon catabolite (de)repression (cellulase formation, cbh1; xylanase formation, xyn1; [beta]-galactosidase formation, bga1), we demonstrated, that only a deletion of both kinases, hxk1 and glk1, leads to derepression, suggesting a catalytic effect to be responsible.<br />Interestingly the induction of cbh1 on the cellulase inducer sophorose and bga1 on D-galactose were impaired in the [Delta]glk1[Delta]hxk1 strain, while the transcript levels of xyn1 on D-xylose were increased in both single and the double deletion strains.

Zuckerkinasen spielen eine zentrale Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel, da sie aufgenommene Zucker phosphorylieren, um ein Entweichen aus der Zelle zu erschweren und sie für den weiteren Abbau vorzubereiten. Der zur Gattung der Ascomyceten gehörende Pyrenomycet Hypocrea jecorina besitzt eine Galaktokinase (gal1), eine Hexokinase (hxk1) und eine Glukokinase (glk1). Es wurde die Rolle dieser Enzyme im Kohlenhydratstoffwechsel allgemein und im Speziellen in Bezug auf die Signalwirkung untersucht.<br />Die Galaktokinase von H. jecorina (GAL1) ist verantwortlich für den ersten Schritt des Leloir Weges und phosphoryliert D-Galaktose zu D-Galaktose 1-phosphat. Im Unterschied zu Hefen wie Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis, in denen die Galaktokinase als Regulatorprotein fungiert und die Aktivierung der Transkription der GAL Gene in Gegenwart von D-Galaktose bewirkt, ist in H. jecorina die Induktion der weiteren Gene des Leloir Weges unabhängig von GAL1. Durch das Ersetzen der H. jecorina GAL1 durch die Galaktokinase von Escherichia coli konnten wir zeigen, dass Galaktokinaseaktivität, aber nicht das GAL1-Protein essentiell für die Induktion der Zellulasen auf Laktose ist. Zusätzlich präsentieren wir Belege für die Existenz eines zweiten D-Galaktose Abbauweges, der über die Reduktion von D-Galaktose zu Galaktitol verläuft. L-Arabinitol 4-Dehydrogenase (lad1) ist für den zweiten Schritt in diesem Weg verantwortlich, weil ein [Delta]gal1[Delta]lad1 Stamm weder auf Galaktitol, noch auf D-Galaktose wachsen konnte.<br />Um eine wiederholte Gendeletion zu erleichtern, wurde die so genannte Blaster Methode verwendet. Die entsprechende Blaster Kassette besteht aus dem H. jecorina pyr4 Gen, flankiert von zwei identischen Sequenzen.<br />Diese Kassette wurde verwendet, um die Gene für die Glukokinase und die Hexokinase auszuschalten. Nach der Deletion des Glukokinasegens wurde sie wieder entfernt, um sie ein zweites Mal für das Hexokinasegen zu verwenden. Stämme, in denen beide Gene deletiert sind, konnten auf D-Glukose, aber auch auf einer Reihe von anderen C-Quellen nicht mehr wachsen. Unter Verwendung von drei Genen, die der Carbon Catabolit (De)repression unterliegen (Zellulase Bildung, cbh1; Xylanase Bildung, xyn1; [beta]-Galaktosidase Bildung, bga1), haben wir gezeigt, dass nur eine Deletion von beiden Genen, hxk1 und glk1, zur Derepression führt, was einen katalytischen Effekt nahe legt. Interessanterweise war auch die Induktion von cbh1 auf Sophorose und von bga1 aufD-Galaktose im doppelt deletierten Stamm beeinträchtigt, während die Transkription von xyn1 auf D-Xylose sowohl in den einzeln deletierten sowie im doppelt deletierten Stamm erhöht war.<br />