Online hyphenation of chromatography and mass spectrometry – elucidating the molecular composition of a biological adhesive from ixodid ticks

Abstract

Unter den Omics-Studien zielt Metabolomics auf die umfassende und quantitative Analyse aller Metaboliten in einem biologischen System ab und spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis von Zellreaktionen, welche sehr wichtige Informationen über biologische Systeme und ihren Stoffwechselstatus liefern. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Methoden für eine zielgerichtete Analyse von Metaboliten unter Einsatz von Gaschromatographie gekoppelt mit Elektronenionisations-Tandem-Massenspektrometrie (GC-EI-MS/MS) und Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Elektrosprayionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) entwickelt. Durch den Einsatz von Multiple Reaction Monitoring (MRM) konnten die Analysen mit hoher Selektivität und Sensitivität durchgeführt werden. Unterschiedliche Metaboliten verschiedenster Metabolitenklassen (Aminosäuren, Kohlenhydrate und die entsprechenden Phosphate und organische Säuren), alles wichtige Vertreter des primären Kohlenstoffkreislaufs, wurden ausgewählt. Hinsichtlich GC wurden zwei Derivatisierungsstrategien, Trimethyl-silylierung (TMS) und Methoximierung in Kombination mit TMS (MeOx/TMS), näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die kombinierte Methode im Vergleich zur alleinigen Durchführung von TMS Vorteile in Bezug auf Derivatisierungsprodukte und Reaktionskinetik aufweist. Bei alleiniger Anwendung von TMS wurden bis zu sieben Derivate für Monosaccharide erhalten. Darüber hinaus bildete die Aminosäure Lysin zwei Derivate: eine einfach oder doppelt silylierte -Aminogruppe. Diese Nachteile konnten durch die kombinierte Derivatisierungsmethode vermieden werden. Eine besondere Beobachtung war jedoch die Bildung von zwei zusätzlichen Glukosederivaten in Gegenwart von Lysin nach erfolgter MeOx/TMS Derivatisierung, die möglicherweise das - und -Anomer der cyclischen Form der Hexose darstellen.Obwohl MeOx/TMS bei mehreren Substanzen die Bildung von zwei Derivaten bewirkte, zeigte die entwickelte GC-EI-MS/MS Methode hinsichtlich der chromatographischen Leistung Vorteile gegenüber LC-ESI-MS/MS: die Zuckeralkohole und Monosaccharide, mit Ausnahme von Ribose, konnten durch GC getrennt, durch LC jedoch nur als C5- und C6-Zucker- und Zuckeralkohol-Summenpeaks erhalten werden. Die ermittelten Nachweis- (LODs) und Bestimmungsgrenzen (LOQs) lagen im niedrigen M-Bereich und sind für GC-EI-MS/MS zumeist niedriger als für LC-ESI-MS/MS.Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung eines von Zecken abgesonderten biologischen Klebstoffes. Im Hinblick auf mögliche Anwendungen im Gesundheitswesen, in der Pharmazie, in der Klebe- und in der Kosmetikindustrie sind biologische Klebstoffe, hergestellt von verschiedensten Tieren, von großem Interesse. Zecken, temporäre Ektoparasiten, ernähren sich ausschließlich vom Blut von Wirbeltieren und sind bekannt vor und während ihrer Blutmahlzeit einen solchen biologischen Klebstoff, den sogenannten Zeckenzement, abzusondern. Diese viskose und klebrige Substanz wird von den Speicheldrüsen der Zecken produziert und härtet nach der Sekretion aus. Die Hauptfunktion des Zements scheint die Verankerung der Zecke durch die Verstärkung der Haftung der Mundwerkzeuge der Zecken am Wirt zu sein. Alle Funktionen des Zements und die detaillierte Zusammensetzung sind jedoch noch nicht vollständig bekannt und erforscht und werden daher hier behandelt.Zeckenzement wurde von in vitro gefütterten Amblyomma hebraeum und Dermacentor marginatus Zecken unter Verwendung eines künstlichen Membranfütterungssystems und unterschiedlichen Fütterungsmedien gesammelt. Aminosäureanalyse von Zementproben wurde durch GC-EI-MS/MS und LC-ESI-MS/MS nach saurer oder basischer Hydrolyse unter Verwendung von Salzsäure (HCl) oder Natronlauge (NaOH) durchgeführt. Nach Ermittlung der Wiederfindungsraten für Aminosäuren unter Verwendung von Standards wurde jedoch festgestellt, dass basische Hydrolyse zu sehr schlechten Wiederfindungen führte, wodurch saure Probenvorbereitung für alle weiteren Analysen verwendet wurde. Instrumentelle Analysen auf Basis von GC-EI-MS/MS und LC-ESI-MS/MS Methoden wurden validiert und erwiesen sich für die Zementanalyse als sehr geeignet. Es wurde festgestellt, dass im Zement mehr als 60% an unpolaren Aminosäuren vorhanden sind (Gly, Leu, Pro, Ala, Phe), wobei Gly der Hauptbestandteil war (25% und 35% des gesamten Zements in Dermacentor marginatus bzw. Amblyomma hebraeum). Der Vergleich beider Spezies ergab, dass beide Klebstoffe sehr ähnlich zusammengesetzt sind und der größte Unterschied in der Menge an Gly besteht.Der Zement zeigte sehr schlechte Löslichkeit in verschiedenen Puffersystemen, jedoch ermöglichten saure Probenvorbereitungsbedingungen eine Proteinauftrennungen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Proteine von Dermacentor marginatus Zement wurden anschließend nach tryptischem In-Gel-Verdau mittels LC-ESI-MS/MS identifiziert. Die Identifizierung von Glycin-reichen Proteinen (GRPs), z.B. das Zementprotein RIM36, bestätigte die Ergebnisse der Aminosäureanalyse. Zusätzlich wurden Proteine, die die Gewebereparatur inhibieren, die die Funktion von Protein abbauenden Enzymen beeinträchtigen, oder einige mit antimikrobieller Aktivität, gefunden. Diese Resultate deuten darauf hin, dass der Zement nicht nur an der Anhaftung, sondern auch am Schutz der Zecke selbst beteiligt ist.

Amongst the omics studies, metabolomics aims the comprehensive and quantitative analysis of all metabolites in a biological system and plays a crucial role in understanding cellular reactions which yield very important information about biological systems and their metabolic status. In the first part of this thesis methodologies for the targeted analysis of metabolites, applying gas chromatography electron ionisation tandem mass spectrometry (GC-EI-MS/MS) and liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) were developed. Highly selective and sensitive analysis was achieved by the application of multiple reaction monitoring (MRM). Different metabolites from several metabolite classes (amino acids, carbohydrates and the respective phosphates and organic acids), yet all important in the primary carbon metabolism, were selected. Two derivatisation strategies for GC, trimethylsilylation (TMS) and methoximation in combination with TMS (MeOx/TMS) were investigated. It could be revealed that compared to exclusively perform TMS the combined method presents benefits regarding derivatisation products and kinetics of the reaction. The formation of up to seven derivatives for monosaccharides was obtained if mere TMS was applied. Furthermore, the amino acid lysine produced two derivatives: a single or double silylated -amino group. The combined derivatisation method prevents these drawbacks. However, an outstanding observation was the formation of two additional glucose derivatives in the presence of lysine after MeOx/TMS, possibly representing the - and -anomer of the cyclic form of the hexose. Although several substances formed two derivatives after MeOx/TMS the chromatographic performance revealed benefits of the developed GC-EI-MS/MS method compared to LC-ESI-MS/MS: Separation of the sugar alcohols and monosaccharides, except ribose, could be achieved by GC, though only sum peaks for C5- and C6-sugars and sugar alcohols could be obtained by LC. In addition to that the GC peak widths had a maximum of 0.27 min compared to several minutes for LC. The obtained limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) were in the low M range and were predominantly lower for GC-EI-MS/MS than for LC-ESI-MS/MS.With respect to potential applications in healthcare, pharmacy, the bonding industry, and cosmetics, biological adhesives produced from various animals are of high interest. Ticks, temporary ectoparasites, are feeding obligatorily on the blood of vertebrates and are known to secret such a bioadhesive called attachment cement prior and during their blood meal. This viscous and sticky substance is produced by the ticks salivary glands and hardens after secretion. The main function of the cement seems to be the anchoring of the tick by strengthening the attachment of the ticks mouthparts to the host. However, all functions of the cement and the detailed composition are not fully understood or explored yet. Thus, the second part of this thesis focused on the characterisation of the tick attachment cement.Tick attachment cement was collected from in vitro fed Amblyomma hebraeum and Dermacentor marginatus ticks using an artificial membrane feeding system and different feeding materials. Amino acid analysis of cement samples was performed by GC-EI-MS/MS and LC-ESI-MS/MS after acidic or alkaline hydrolysis using hydrochloric acid (HCl) or sodium hydroxide (NaOH). However, after studying the amino acid recovery of standard proteins, alkaline hydrolysis was found to yield very poor recoveries and acidic sample preparation was chosen for further analysis. Instrumental analyses on the basis of GC-EI-MS/MS and LC-ESI-MS/MS were validated and showed to be very suitable for cement analysis. High amounts of non-polar amino acids (Gly, Leu, Pro, Ala and Phe) were found to be present in the cements, more than 60%, with Gly being the major component (25% and 35% of the total cement in Dermacentor marginatus and Amblyomma hebraeum, respectively). The comparison of both species showed that both adhesives are rather similar with the largest difference in the amount of Gly.The cement showed very poor solubility in different buffer systems, but using acidic conditions allowed for sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for protein separation. Proteins of Dermacentor marginatus cement were identified after tryptic in-gel digestion using LC-ESI-MS/MS. The identification of glycine-rich proteins (GRPs), e.g. the cement protein RIM36, confirmed the findings from amino acid analysis. Additionally, proteins that inhibit tissue repair, others hampering the function of protein degrading enzymes or some with antimicrobial activity were found. These findings indicate that the cement is not only involved in attachment, but also in protecting the tick itself.