Three-dimensional super-resolution microscopy of the immunological synapse

Abstract

T-Zellen sind Teil unseres adaptiven Immunsystems und für die Erkennung von Antigenen in unserem Körper verantwortlich. Durch Binden des T-Zell Rezeptors (TCR) an ein Antigen, welches durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) an der Zellmembran von antigen-präsentierenden-Zellen (APC) präsentiert wird, werden T-Zellen aktiviert. Gemäß dem kinetischen Segregationsmodell der T-Zell-Aktivierung spielt die Topographie der immunologischen Synapse eine große Rolle im Antigen-Erkennungsprozess. Aufgrund von Größenausschlusseffekten beeinflusst die Topographie der Synapse die Rezeptorbindungsraten und die Segregation von Proteinen. Daher ist es wichtig, die 3D-Topographie der Synapse mit hoher Präzision zu bestimmen. Aktuelle Methoden liefern nur recht grobe Bilder der Proteinverteilung innerhalb der Synapse. Darüber hinaus ist die Erfassung der Verteilung von Proteinen in allen drei Dimensionen noch herausfordernder als in zwei, da die Auflösung entlang der optischen Achse von Mikroskopen gering ist.Wir haben eine 3D-Superauflösungsmethode entwickelt, die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) mit defokussierter Mikroskopie kombiniert, welche Effekte der Fluoreszenzemission im superkritischen Winkel auf die Form der Punktbildfunktion ausnutzt. Die Methode lässt sich leicht in für die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie ausgestatteten Aufbauten implementieren. Wir haben das Arbeitsprinzip an einer Reihe verschiedener Proben mit bekannter Struktur validiert, wie z. B. fluoreszenz-beschichtete Glaskugeln, 30 nm lange DNA-Origami-Nanostrukturen und Kernporenkomplexe, und konnten die zugrunde liegenden Strukturen erfolgreich auflösen.Schließlich haben wir die Methode auf T-Zellen angewandt, um die räumliche Organisation des T-Zell-Rezeptors innerhalb der Synapse zu untersuchen. Experimente wurden an hybriden Synapsen zwischen primären T-Zellen und funktionalisierten Lipidmembranen durchgeführt. Wir erreichten eine isotrope Lokalisierungspräzision unter 15 nm. Wir quantifizierten die Membranfluktuationen auf der T-Zelle sowie den Abstand des TCRs in Bezug auf die Lipidmembran. Unsere Daten zeigen durchschnittliche Abstände von 18 nm bis 31 nm für aktivierende bzw. nicht-aktivierende Lipidmembranen. Zusätzlich korrelierten wir die 3D-Superauflösungsbilder mit beugungsbegrenzten Bildern der Immunsynapse, die durch Interferenzreflexionsmikroskopie zur Kreuzvalidierung der beiden Techniken erhalten wurden.

T cells are part of our adaptive immune system and are responsible for recognition of antigens in our bodies. T cell activation is triggered upon binding of the T cell receptor (TCR) to the major histocompatibility complex loaded with antigenic peptide (pMHC), which is presented on the surface of antigen presenting cells (APC). According to the kinetic segregation model of T cell activation, topography of the immunological synapse plays a large role in the antigen recognition process. The synapse topography affects receptor binding rates and the mutual segregation of proteins due to size exclusion effects. It is hence important to determine its 3D topography with high precision. Current methods provide only rather coarse images of the protein distribution within the synapse. Moreover, capturing the distribution of proteins in all three dimensions is even more challenging as the resolution along the optical axis of microscopes is lower.We have developed a 3D super-resolution method that combines stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) with defocused imaging which exploits effects of the supercritical angle fluorescence on the shape of the point spread function. The method is easily implementable in setups already equipped for single molecule localization microscopy. We have proven the working principle on a number of different samples with known ground truth, such as fluorescently coated glass spheres, 30 nm long DNA origami nanorulers and Nuclear Pore Complexes, successfully resolving the underlying structures.Finally, we have applied the method to T cells to study the spatial organization of the T cell receptor within the synapse. Experiments were performed on hybrid synapses between primary T cells and functionalized glass-supported lipid bilayers. We achieved isotropic localization precision below 15 nm. We quantified membrane fluctuations and the cleft size within the synapse by mapping the position of the TCR with respect to the supported lipid bilayer. Our data show average distances of 18 nm up to 31 nm for activating and non-activating bilayers, respectively. Additionally, we correlated the 3D superresolution images with diffraction limited images of the immune synapse obtained by interference reflection microscopy for cross-validation of the two techniques.