Investigation of the effect of complex raw materials using metabolic flux balancing - a case study on penicillin fermentation

Abstract

Die Optimierung des Nährmediums ist oft einer der ersten, aber auch der anspruchsvollsten Schritte in der Entwicklung von Bioprozessen aufgrund ihrer Komplexität. Das führt oft zu Kompromissen in der experimentellen Methodik wie der Verwendung von Schüttelkolben. Diese werden zwar wegen ihrer Einfachheit und der leichten Parallelisierbarkeit verwendet, die Prozessbedingungen sind aber oft weit entfernt von denen in der industriellen Anwendung. In anderen Fällen führt die Komplexität des Prozesses zu einer Reduktion der untersuchten Faktoren basierend auf der Einschätzung von Experten. Dies kann problematisch sein, wenn dieses Wissen lediglich qualitativ ist oder bestimmte Aspekte noch völlig unbekannt sind. Weiters werden aus ökonomischen Gründen oft billige Komplexmedien verwendet, welche aber das Prozessverständnis erschweren und zu zusätzlicher Varianz über Unterschiedein den Chargen führen.Zwar können Fortschritte in der Analytik viele dieser Probleme lösen, aber bereits jetzt gibt es etablierte mathematische Methoden, welche den Anwender unterstützen können bessere Entscheidungen zu treffen.In dieser Arbeit wird die metabolische Flussanalyse angewandet, um den Einfluss von komplexen Medienauf Fed-Batch-Fermentationen besser zu verstehen. In diesem spezifischen Fall wurde die Produktiondes antibiotischen Peptids Penicillin durch Penicillium chrysogenum untersucht, in welcher Maisquellwasserals N ̈ahrstoffzusatz verwendet wird, um viele hilfreiche Substanzen bereit zu stellen, wie zum BeispielAminos ̈auren. Durch diese Untersuchungen konnte folgendes Wissen etabliert werden:• Die Berechnung der Raten wird stark dadurch beeinflusst, ob die Freisetzungskinetik der gebundenen Aminosäuren miteinbezogen wird. In einigen Fällen führt dies sogar zur Veränderung des Vorzeichens. Dadurch ̈andert sich die Interpretation des physiologischen Zustands der Zelle von Grundauf.• Durch die Methode der metabolischen Flussanalyse konnte nicht nur der Effekt von spezifischen Aminosäuren auf Penicillin- und Biomasseproduktion quantifiziert, sondern auch der Mechanismus dahinter untersucht werden.Die Vorteile dieses Workflows sind die einfache Anwendung und dessen mechanistische Grundlage.Auf diese Art und Weise kann qualitatives Expertenwissen ̈über den Metabolismus zu einem Model zusammengefügt werden, welches Voraussagen und bessere Entscheidungen in der Prozessoptimierung ermöglicht.

Media optimization is often one of the first but also the most challenging steps in bioprocess development due to its sheer complexity. This can lead to compromises in the experimental set up, such as in the use of shake flask experiments. They are used because they are less laborious and easy to run in parallel, however, the conditions inside the shake flasks are often quite different from the ones encountered in the process of interest. In other cases the complexity of the process leads to a restriction of investigated factors based on expert knowledge. This can be problematic if the expert knowledge isonly qualitative or if gaps in knowledge exist. Additionally, due to economic reasons, the use of complex media is in many cases preferred, which further complicates process understanding and introduces new uncertainty through lot-to-lot variability.While advances in analytics and instrumentation might be able to solve many of these problems, currently accessible and well established modelling methods can already guide and help the user in making better decisions based on the available data. Within this thesis the use of metabolic flux analysis is exploredas a tool to aid in understanding the role of complex media during a fed-batch process. The specific example chosen was production of the antibiotic peptide penicillin by Penicillium chrysogenum, which uses corn steep liquor as media additive to provide many beneficial substances such as amino acids. Based on these investigations, the following could be demonstrated: i) The uptake rates are drastically influenced by incorporation of release kinetics of bound amino acidsin corn steep liquor, in some cases even changing the sign of the uptake rates. This fundamentallychanges the interpretation of the physiological state of the cell. ii) Using metabolic flux analysis, not only the effects of different amino acids on penicillin and biomassformation could be ranked and quantified, with the mechanistic model the mode of action and reasonsfor different effects could be investigated. The advantages of the proposed workflow are its easy application, and its well-defined mechanistic basis.In this manner, it can be used for ordering qualitative expert knowledge about metabolism into a modelmaking predictions on possible limitations and improve decision making.