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Einleitung: Das Ziel dieser Arbeit war es Klärungsmethoden zu entwickeln und bestehende Methoden zu verbessern, die eine hohe Transparenz bei Proben erzielen können, während sie die Morphologie des Gewebes nicht beeinträchtigen und kompatibel mit verschiedenen molekularen Markierungsmethoden sind, wie z.B. transgenes Fluoreszenzsignal, Immunohistochemie und RNA in situ Hybridisierung. Diese Klärungsmethoden sollten die 3D Systemuntersuchung (vom einzelnen Organ bis zum ganzen Tier) von verschiedenen Modellorganismen ermöglichen. Diese wären Maus (mus musculus), Zebrafisch (danio rerio), Fruchtfliege (Drosophila melanogaster), Axolotl (Axolotl mexicanum), Borstenwurm (Platynereis dumerilii), Hawaiianischer Bobtail-Tintenfisch (Euprymna scolopes) und der Langflossen-Küstenkalmar (Doryteuthis pealeii). Methodologie: [1] Die wasserbasierende CLARITY und CUBIC, als auch die auf Dehydration basierende 3DISCO Klärungsmethode wurden an den Gehirnen von transgenen Thy1-GFP-M und Thy1-YFP-H Mäusen getestet und nach den folgenden Kriterien evaluiert: (i)Schwierigkeit der Implementierung, (ii) Toxizität, (iii) Klärungseigenschaften, (iv) Zeitaufwand, (v) Morphologieerhalt, (vi) Eigenschaften des Refraktionsindex (RI) angleichenden Mediums,(vii) Erhalt und Langzeitstabilität des Fluoreszenzsignals und (viii) die allgemeinen Kosten. Zum Schluss wurden neue Chemikalien getestet um die zuvor erwähnten Eigenschaften zu verbessern. [2] Die auf Wasser basierenden Methoden ScaleS und CUBIC und die dehydrationsbasierende Klärungsmethode 3DISCO wurden an verschiedenen transgenen Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) getestet und nach den folgenden Kriterien evaluiert: (i) Klärungseigenschaften, (ii) Morphologieerhalt, (iii) Eigenschaften des RI angleichenden Mediums, (iv) Depigmentierungsfähigkeit und (v) Erhalt und Langzeitstabilität des Fluoreszenzsignals. [3] Das wasserbasierende FlyClear Protokoll wurde getestet an Wildtypen und in manchen Fällen auch an transgenen Mäusen, Axolotln, Zebrafischen, Borstenwürmern, Hawaiianischen Bobtail-Tintenfischen und Langflossen-Küstenkalmaren auf (i) Klärungseigenschaften, (ii) Morphologieerhalt, (iii) Eigenschaften des RI angleichenden Mediums, (iv) Depigmentierungsfähigkeit, (v) Erhalt und Langzeitstabilität des Fluoreszenzsignals und Kompatibilität mit molekularen Markierungsmethoden wie z.B Immunhistochemie und RNA in situ Hybridisierung. leichzeitig mit [1-3] wurden verschiedene auf asphärischen Linsen basierende Lichtblattgeneratoren von Dr. Saiedeh Saghafi und verschieden Bildbearbeitungsprogramme von Dr. Klaus Becker entwickelt und an den zuvor genannten geklärten Proben, in ihrer Fähigkeit die Bildqualität zu erhöhen, getestet. Ergebnisse: [1] Mehrere Verbesserungen wurden beim Klären von transgenen Mäusegehirnen erzielt: (i) Die schon bestehende CLARITY Methode wurde verbessert indem die elektrophoretischen Gewebeklärkammer optimiert wurde, dies führte zu einer verkürzten Inkubationszeit und einer uniformen Delipidierung. Zusätzlich, wurde ein neues, kostengünstiges RI angleichendes Medium entwickelt welche eine niedrige Viskosität, eine langanhaltende Gewebetransparenz und Fluoreszenzstabilität bewirkt. (ii) Das 3DISCO Protokoll wurde in Bezug auf die Stabilität des Langzeit-Fluoreszenzerhaltes verbessert, welches im sDISCO Protokoll resultierte. [2] Die CUBIC Methode wurde adaptiert indem ein Aminoalkohol mit stärkeren Depigmentierungseigenschaften hinzugefügt wurde. Dies führte zu dem ersten Klärungsprotokoll (FlyClear) welches das transgene Fluoreszenzsignal von D. melanogaster, während verschiedenen Entwicklungsstadien (drittes instar Larvenstadium, Pre-puppe, Puppe und adulte Fliege) ehthält. [3] Das Weiterentwickeln der FlyClear Methode resultierte in einen sehr vielseitigen Depigmentierungs- und Klärungsprotokoll (DEEP-Clear) für fünf, bis dahin noch nicht geklärte, wichtige Modellorganismen (Zebrafisch, Axolotl, Borstenwurm, Hawaiianischer Bobtail-Tintenfisch und der Langflossen-Küstenkalmar). Die Methode führte zu einer sehr guten Bewahrung der Morphologie der Proben und zu einer hohen Transparenz von heterogenem Gewebe. Zudem ist DEEP-Clear kompatibel mit wichtigen Markierungsmethoden wie fluoreszenten Reportersignalen, Immunhistochemie (für ganze Tiere bis zu 2.5 cm Länge), RNA in situ Hybridisierung und 5-Ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) Markierung. [4] Die, für das FlyClear verwendeten Proben wurden mit dem von Dr. Saiedeh Saghafi entwickelten asphärischen Lichtblattgenerator mit eine Powellinse aufgenommen welcher mit einer Lochblende ausgestatte war. Manche Probenaufnahmen wurden mit einem von Dr. Klaus Becker geschriebenen „multiview combining“ Algorithmus bearbeitet was zu einer isotropen Auflösung der 3D Bilder führte. Die, für das DEEP-Clear verwendeten Proben wurden mit einen asphärischen Lichtblattgenerator mit zwei Powellinsen aufgenommen und die Bilder wurden mit einem, von Dr. Klaus Becker, entwickelten Deconvolution Programes, welches eine theoretische Punktstreufunktion eines Lichtbandmikroskopes verwendet, bearbeitet. Dies führte zu isotropen Bildern von Proben, die bis zu 2.5 cm lang waren. Schlussfolgerung: Mit der Verbesserung und Entwicklung verschiedener Klärungsmethoden, Lichtblattgeneratoren und bildbearbeitenden Computerprogramme für das Lichtblattmikroskope, konnte ein wichtiger Beitrag zur Erforschung von unterschiedlichen Modelorganismen und dabei zur Beantwortung verschiedenster biologische Fragestellungen geleistet werden wie z.B. die Beschreibung des verlustes der Kommisure-neurone in D. melanogaster Mutanten des Ahesionsmolekühls Neuroglian oder die Wachstumsdynamik im P. dumerili Auge in der Sepie oder in Axolotl. Das demonstrierte Spektrum an technischen Kompatibilitäten bietet neue und einzigartige Möglichkeiten, den Aufbau und Umbau innerer Gewebe in einem intakten Organismus bei Einzelzellauflösung umfassend zu analysieren.
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Introduction: The aim of this work was to develop and improve clearing methods that yield high sample transparency while preserving tissue morphology and, at the same time being compatible with various molecular labelling techniques e.g. transgenic fluorescent signal, immunohistochemistry and RNA in situ hybridisation. These clearing methods should facilitate the 3D system interrogation (from single organs to entire animals) of multiple model organisms, namely: mouse (mus musculus), zebrafish (danio rerio), fruit fly (Drosophila melanogaster), axolotl (Axolotl mexicanum), bristle worm (Platynereis dumerilii), Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes) and longfin inshore squid (Doryteuthis pealeii). Methodology: [1] The water-based CLARITY and CUBIC, as well as the dehydration based 3DISCO and uDISCO clearing methods were tested on adult transgenic Thy1-GFP-M and Thy1-YFP-H mice and evaluated according to the following criteria: (i) difficulty of implementation, (ii) toxicity, (iii) clearing properties, (iv) duration, (v) morphology preservation, (vi) refractive index (RI) matching media properties, (vii) fluorescent signal preservation and long term stability and (viii) overall cost. Finally, new chemicals were tested to improve the aforementioned properties. [2] The water-based ScaleS and CUBIC, and the dehydration based 3DISCO clearing method were tested on different transgenic Drosophila melanogaster (fruit flies) and evaluated according to the following criteria (i) clearing properties, (ii) morphology preservation, (iii) RI matching media properties, (iv) depigmentation properties and (v) fluorescent signal preservation and long term stability. Finally, new chemicals were tested to improve the aforementioned properties. [3] The water-based FlyClear protocol was tested on wild type and in some cases transgenic mouse, axolotl, zebrafish, bristl worm, Hawaiian bobtail squid and longfin inshore squid for its (i) clearing properties, (ii) morphology preservation, (iii) RI matching media properties, (iv) depigmentation properties and (v) fluorescent signal preservation and long term stability in cases of transgenic animals, as well as (vi) compatibility with molecular labelling methods (e.g. immunohistochemistry and RNA in situ hybridisation) [4] Alongside [1-3], different aspherical lens-based light-sheet generators, developed by Dr. Saiedeh Saghafi, and image post-processing computer programs, developed by Dr. Klaus Becker, were tested on the aforementioned cleared specimens for their ability to improve image quality. Results: [1] Several improvements were made in transgenic mouse brain clearing: (i) The existing CLARITY method was improved, including the optimisation of the electrophoretic tissue clearing chamber (ETC), leading to shortened incubation times and uniform tissue delipidation. Further, a new cost-effective RI matching medium which has low viscosity, results in excellent and lasting tissue transparency, and provides long term fluorescence stability was developed. (ii) The 3DISCO protocol was improved in respect of long-term fluorescent signal stability resulting in the new sDISCO protocol. [2] The CUBIC method was adapted by adding an aminoalcohol with strong depigmentation properties resulting in the first protocol (FlyClear) which preserves transgenic fluorescent signals in D. melanogaster at different developmental stages (3rd instar larvae, prepupa, pupa and adult fly). [3] The adaptation of the FlyClear method resulted in a highly versatile depigmentation and clearing protocol (DEEP-Clear) for five, so far never cleared, important model organisms (zebrafish, axolotl, Hawaiian bobtail squid, longfin inshore squid and bristle worm). This method showed excellent preservation of sample morphology and a high level of heterogeneous tissue transparency. Further, DEEP-Clear is compatible with key active labelling methods, namely transgenic fluorescent reporter signals, immunohistochemistry (whole-mount in animals up to 2.5 cm length), RNA in situ hybridization and 5-Ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) labelling. [4] The samples used for the FlyClear protocol were imaged using an optical unit containing various meso-aspheric optical elements (e.g. one Powell lens and two acylinder lenses) equipped with a soft aperture to generate a thin light-sheet, designed by Dr. Saiedeh Saghafi. In addition, some of the samples were processed with a multiview combining algorithm, developed by Dr. Klaus Becker, resulting in isotropic 3D images. The samples used for the DEEP-Clear were imaged with an upgraded light-sheet system. The images were further processed with a deconvolution program, developed by Dr. Klaus Becker, using a theoretical point spread function resulting in isotropic images of samples up to 2.5 cm in length. Conclusion: Different clearing methods, imaging tools and computational programs for the light-sheet microscope were improved and developed, that contribute to the research of diverse animal models, and thereby also to the exploration of different biological questions e.g. the loss of commissural projections for the adhesion molecule Neuroglian in D. melanogaster mutants or the growth dynamics in bristle worm eyes, axolotl and squid. The demonstrated spectrum of technical compatibilities provides novel and unique opportunities o comprehensively analyse the assembly and remodelling of internal tissues in an intact organism at a single-cell resolution.
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