Synthesis of sulfated O- and C- glucosides and -amines - development of novel enzyme substrates to indicate mucopolysaccharidosis in newborn

Abstract

Mukopolysaccharidosen (MPS) werden zur Gruppe der lysosomalen Speicherkrankheiten (LSD) gezählt. Hierbei führt ein Mangel an bestimmten lysosomalen Enzymen zur stetigen Anreicherung der abzubauenden Glycosaminoglykane (GAG) innerhalb des Lysosoms. Dadurch kommt es in weiterer Folge zur Dysfunktion der Zelle und einer Schädigung des gesamten Organismus. Da die Symptome dieser Krankheiten sehr vielfältig und unterschiedlich stark ausgeprägt sein können, werden sie meist zu spät diagnostiziert. Ohne entsprechend früher Behandlung führen MPS zu irreparablen Schäden bis hin zum Tod des Patienten. Die Entwicklung neuer Therapieansätze für eine wachsende Anzahl von MPS, macht die Früherkennung dieser Krankeiten immer wichtiger. Bisherige Diagnosemthoden messen die GAG-Konzentration im Urin, welche jedoch bei vielen Patienten nur gering oder erst bei fortgeschrittenem Krankheitsverlauf erhöht ist. Durch die rasante Entwicklung der Massenspektrometrie wurden Enzym Assays mit tandem-massenspektrometrischer Detektion ermöglicht. Dabei wird Blut des Patienten mit einem künstlich hergestellten Substrat, welches dem natürlich vorkommenden GAG nachempfunden ist, inkubiert und durch Tandem-Massenspektrometrie die Enzymaktivität bzw. Produktbildung verfolgt. Langfristiges Ziel ist die Implementierung dieser Enzym Assays in das bereits routienmäßig durchgeführte Neugeborenen-Screening (NBS). Diese Arbeit beschreibt die Herstellung neuartiger Substrate zur frühzeitigen Diagnose des Sanfilippo Syndroms (MPS III). Bei MPS III kommt es, durch die mangelnde Aktivität vier verschiedener lysosomaler Enyzme, zur Akkumulation des GAGs Heparansulfat (HS). HS besteht aus sich wiederholenden Disaccharid-Einheiten, welche aus Uronsäuren -verknüpft mit Glucosaminderivaten aufgebaut sind. Ein Mangel an einem dieser vier Enyzme führt zum Auftreten eines eigenen Subtyps von Sanfilippo: MPS IIIA, IIIB, IIIC und IIID. Im Falle von MPS III können alle vier Enzyme Glucosamin- bzw. N-Acetylglucosamindrivate abbauen, weshalb diese beiden Verbindungen als Grundbausteine für die Synthese der Substrate dienten. Neben einer gewissen Ähnlichkeit zu dem natürlichen Substrat HS, müssen die Zielsubstanzen zusätzliche Gruppen enthalten die eine Detektion mittels Tandem-Massenspektrometrie erleichtern. Um beide Eigenschaften erreichen zu können, wurden die Zielverbindungen in zwei Bereiche aufgeteilt. Ein Bereich hatte die Synthese der modifizierten Monosaccharide zur Aufgabe (Donor), der andere Teil diente zur Optimierung unserer Zielsubstanzen hinsichtlich Massenspektrometrie (Marker). Eine kupfer-katalysierte Alkin-Azid Cycloadditon (CuAAC) sollte die getrennt voneinander optimierten Bereiche anschließend vereinen. Um die unerwünschte Spaltung der glykosidischen Bindung durch weitere anwesende Enzyme während der Inkubation, oder durch Ionisation im MS zu unterbinden, wurden stabile C-Glykoside ebenfalls synthetisiert. Deshalb wurden einerseits gewöhnliche O-Glykoside (O-Strategie) und andererseits C-Glykoside (C-Strategie) synthetisiert.

Mucopolysaccharidoses (MPS) belong to the group of lysosomal storage diseases (LSD). Deficiency on certain lysosomal enzyms leads to a steady accumulation of glycosaminoglycans (GAG) within lysosyms. Subsequently, this leads to a dysfunction of the cell and to damage of the whole organism. Because of the wide variabilty of the symptoms and often relatively mild somatic features, it is often diagnosised very late. MPS cause, without an appropriate and especially early treatment, irreversible damages and end in an early death. Through the development of novel therapies for a growing number of various MPS types, an early diagnosis is becoming more and more important. Present diagnosis is done by measuring GAG concentration in urine, which leads often to a very late diagnosis, because urinary excretion of GAGs is only mildly elevated in many MPS patients. The rapid development of mass spectrometry has made tandem mass-based enzyme assays for diagnosis possible. Therefore patient-s blood is taken and incubated with an artificial substrate, which resembles naturally occurring GAG. After quenching, enzyme activity respectively product formation is detected by mass spectrometry. Long-term aim is the implementation of such enzyme assays in the already established Newborn Screening (NBS). Task of this thesis was the synthesis of novel enyzme substrates to indicate Sanfilippo syndrome (MPS III) in Newborn. MPS III is characterized by an accumulation of undegraded heparan sulfate (HS), caused by a deficiency of four different lysosomal enzymes. HS consists of repeating disaccharide units of uronic acid alternating with --linked glucosamine residues. The lack of any of these four enzymes leads to the occurrence of a distinct Sanfilippo subtype: MPS IIIA, IIB, IIIC and IIID. As in the case of MPS III all four enzymes are able to degrade glucosamine and N-acetylglucosamine derivatives. So, different glucosamine and N-acetylglucosamine derivatives were synthesized, to be used as artificial substrates. Beside a certain resemblance to the natural substrate HS, every target compound should have additional groups, which make detection via tandem mass spectrometry easier. Therefore, the target compound was broken down into two parts, one dealing with the synthesis of monosacchride-derived substrates (donor) and the other part focused on optimization towards mass spectrometry (marker). Coupling of these two parts was done by a high yielding copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC). To prevent unwanted enzymatic hydrolysis of the substrate molecules, caused by other enzymes present in the media or while ionization during MS measurement, chemically and enzymatically more stable C-linked glycosides were also synthesized. So two different strategies, for the synthesis of common O-glycosides (O-strategy) on one side, as well as a C-strategy for making C-glycosides on the other were developed.