Microfluidic engineering for biomedical applications

Abstract

Die Miniaturisierung von konventionellen Laborgeräten sowie die Entwicklung neuartiger Analysemethoden zählt zu den Hauptaufgaben der mikrofluidischen Forschung. In diesem Zusammenhang wurden beachtliche Fortschritte erzielt und eine Vielzahl von Analysemethoden konnten bereits miniaturisiert werden. Im Zuge dieser Dissertation wurden drei mikrofluidische Prototypen entwickelt. Zwar unterscheiden sich die Prototypen in ihrer Anwendung, jedoch verfolgt deren Entwicklung das gemeinsame Ziel wichtige mikrofluidische Probleme zu überwinden und die Analysekompetenz mikrofluidischer Systeme zu erweitern. Die Herstellungsmethoden, die für die Produktion der mikrofluidischen Geräte zur Anwendung kamen, sind vielfältig und reichen von einem preiswerten Rapid-Prototyping-Verfahren bis zu hochentwickelten Fertigungstechniken der Siliziumtechnologie. Eine wesentliche Voraussetzung für ein vollständig miniaturisiertes "lab-on-a-chip" ist eine integrierte Probenaufbereitung. Diese Vorbereitungsschritte umfassen, z.B. das Fokussieren, Separieren, Mischen, Konzentrieren oder den gezielten Transport von Zellen oder Partikeln in Suspension. Einerseits wurde die Miniaturisierung der Probenvorbereitung von der mikrofluidischen Forschungsgemeinschaft bisher eher vernachlässigt und die Mehrheit dieser Arbeitsschritte wird nach wie vor konventionell, d.h. "off-chip", durchgeführt. Andererseits gilt das Fehlen einer integrierten Probenaufbereitung als eine der wesentlichen Herausforderungen, die die kommerzielle Nutzung von mikrofluidischen Geräten bisher verhindert hat. In dieser Arbeit wird eine mikrofluidische Struktur, die Mikroverwirbelungen erzeugt und verstärkt, vorgestellt. Solche Wirbel stellen ein vielseitig einsetzbares mikrofluidisches Werkzeug dar, z.B. um Zentrifugen zu miniaturisieren, für die Herstellung von Mikromischern sowie für das Immobilisieren, Fokussieren oder Separieren von bestimmten Zellen aus einer Probe. Bei laminaren Strömungsverhältnissen benötigt man hohe Flussraten, um Mikroverwirbelungen zu erzeugen. Die vorgestellte mikrofluidische Struktur wurde mittels numerischer Simulation optimiert, um die Mikroverwirbelungen zu maximieren und so die notwendige Flussrate und das benötigte Probenvolumen zu minimieren. Als praxisnahes Anwendungsbeispiel wurde das neuartige Kanaldesign erfolgreich eingesetzt, um Plasma von einer Blutprobe zu gewinnen. Ein besonders aktives Forschungsgebiet der Mikrofluidik beschäftigt sich mit der Detektion, dem Zählen und der Analyse von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs). Dieses Thema hat in den letzten Jahren sehr viel Interesse hervorgerufen, weil durch die Erforschung der Krebszellen im Blutkreislauf ein signifikanter Beitrag zum Verständnis der bei der Ausbreitung von Tumoren involvierten Prozesse geleistet und die Behandlung von Tumoren verbessert werden könnte. Eine große Herausforderung bei der Erforschung von CTCs ist deren außerordentlich niedrige Konzentration (1 - 10 CTCs pro 10mL Blut von Krebspatienten gegenüber ungefähr 7*10^6 Leukozyten und ungefähr 5*10^9 Erythrozyten pro 1mL Blut). Zum Immobilisieren von CTCs werden Kanalwände mit Stoffen, die an CTCs binden, funktionalisiert. Um CTCs mit diesen funktionalisierten Oberflächen detektieren zu können, muss sichergestellt werden, dass die Zellen in Kontakt mit der Oberfläche kommen. Aufgrund der laminaren Strömungsverhältnisse, die in mikrofluidischen Systemen bei niedriger Reynoldszahl inhärent sind, müssen hierfür Verwirbelungen erzeugt werden. Das Strukturieren der Kanalwände hat sich als effektive passive Methode bewährt, um die Wahrscheinlichkeit eines Kontakts von Zellen mit der Oberfläche zu erhöhen. Die vorgestellte mikrofluidische Plattform beinhaltet ein geometrisch optimiertes Kanaldesign in Form einer Fischgrätenstruktur. Dadurch wird ein chaotisches Flussprofil erzeugt und so die Anzahl der zellulären Interaktionen mit der reaktiven Kanaloberfläche sowie die Effizienz der Detektionsmethode maximiert. Im Zuge dieser Dissertation wurden 3 verschiedene Fischgrätengeometrien und ein unstrukturierter mikrofluidischer Kanal untersucht, charakterisiert und deren Immobilisationsrate ermittelt. Ein Vergleich der Messergebnisse zeigt, dass durch den Einsatz des effizientesten Fischgrätendesigns die CTC-Immobilisationsrate mehr als verfünffacht werden kann. In der mikrofluidischen Forschung wurde Milch bisher kaum untersucht. Muttermilch (MM) ist die beste Ernährungsmöglichkeit für Kleinkinder, um deren Wachstum und gesunde Entwicklung sicherzustellen. Für Säuglinge stellt MM eine ausreichende Nahrungsquelle dar, da alle notwendigen Nährstoffe enthalten sind. Bei der Betreuung und Versorgung von Kindern mit geringem Geburtsgewicht ist die Quantifizierung wesentlicher Bestandteile der MM besonders wichtig. Aus diesem Grund wurden kommerzielle Geräte zur Analyse von MM entwickelt. Bisher können diese Apparate die Konzentration von Kalzium, eines der wichtigsten Nährstoffe für Skelettwachstum und Knochenmineralisierung nach der Geburt, nicht bestimmen. In dieser Dissertation wird ein mikrofluidisches Analysesystem zur Quantifizierung des Kalziumgehalts in MM vorgestellt. Die Analyse dauert wenige Minuten und benötigt ein Proben- und Reagenzvolumen von jeweils nur 5µL. Das entwickelte mikrofluidische Messgerät weist ein lineares Verhalten für Kalziumkonzentrationen von 1mmol/L bis 4mmol/L auf. Die Erweiterung des Systems für die Messung mehrerer wichtiger Nährstoffe ist möglich. Studien der Weltgesundheitsorganisation haben ergeben, dass jährlich 20 Millionen Neugeborene mit geringem Geburtsgewicht auf die Welt kommen. Über 90% dieser Kinder werden in Entwicklungsländern geboren. Mit Hilfe der hier verwendeten kosteneffizienten Rapid-Prototyping-Technologie könnte ein leistbares medizinisches Diagnosegerät gefertigt werden, welches in diesen Regionen verwendbar wäre.

The miniaturization of benchtop analytical instruments as well as the development of novel analytical methods is one of the key objectives in microfluidic research. In this context, significant progress has been made and manifold analysis techniques have been presented on-chip. In the course of this thesis, three microfluidic prototypes have been investigated. Each different in application, common in terms of tackling important microfluidic issues and created in an effort to add analysis competence to the microfluidic portfolio. Various fabrication methods are utilized for the realization of these microfluidic devices, ranging from low-cost rapid prototyping to highly sophisticated and precise silicon micromachining techniques. To obtain a fully miniaturized lab-on-a-chip, sample preparation is a crucial precondition. These preparing steps include but are not limited to focusing, separating and concentrating cells or particles in suspension as well as mixing and exposing targets to samples. The majority of these procedures continue to be performed off-chip and the topic of integrated sample preparation seems to be regularly omitted by the microfluidic community. Off-chip sample preparation has been identified as one of the key challenges to commercialization of microfluidic devices. In this thesis, a microfluidic flow structure that induces and enhances microvortices is introduced. These recirculating flows are a versatile microfluidic tool, e.g., for realization of on-chip centrifuges, fabrication of micromixers, manipulation, trapping, focusing or separation of target cells. Under laminar flow L conditions the generation of microvortices demand high flow rates. The presented microfluidic flow structure is numerically optimized to enhance vortex growth, thereby reducing flow rate and the consumption of reagents. The novel channel design is successfully applied to separate plasma from a sample of human blood. The capture, enumeration and analysis of circulating tumor cells (CTCs) represents a very active field of academic microfluidic research that has gained a lot of interest in recent years as it has the potential to significantly contribute to cancer research and, foremost, improved cancer treatment. Reagents that are binding to the extremely rare CTCs (1 - 10 CTCs per 10mL of most cancer patient's peripheral blood versus approx. 7*10^6 leukocytes and approx. 5*10^9 erythrocytes per 1mL of blood) have been developed. If surfaces are functionalized, i.e., biologically or nano activated, to capture CTCs, it is essential to ensure cell-surface-contacts. Due to the laminar flow, which is inherently present in microfluidic systems with low Reynolds number, turbulences, i.e., chaotic flow, needs to be introduced. Structuring the channel wall has proven to be an effective passive method to increase the probability of cell-surface-contacts. The presented microfluidic platform incorporates a geometrically optimized herringbone-structured channel design, which establishes a chaotic flow profile, thereby maximizing the number of cellular interactions with the reactive channel surface and, hence, capture efficiency. In the course of this thesis, 3 different herringbone geometries are investigated and compared to each other as well as an unstructured microfluidic channel in terms of CTC recovery rate. By utilizing the best performing herringbone-structured channel the recovery rate can be improved by more than a factor of 5 compared to the smooth channel design. Milk is a complex sample matrix and has hardly been used as sample liquid in microfluidic research. Human milk represents the best nutritional choice to safeguard infant growth and healthy development because it is a complete diet for babies that provides all necessary building blocks. Quantifying the constituents of milk is of high importance when caring for low birth weight infants. Therefore, commercial bedside human milk analyzers have been developed. However, so far they are incapable of measuring calcium, one of the key nutrients to ensure adequate postnatal skeletal growth and bone mineralization. This dissertation reports on a microfluidic analysis system for measuring calcium levels in human milk within minutes, requiring a reagent and sample volume as low as 5µL. The final microfluidic device shows a linear behavior in the range from 1mmol/L up to 4mmol/L calcium concentration. The analysis platform offers the potential to extend the measurement capabilities to other important nutrients. According to the World Health Organization 20million low birth weight infants are born each year. Over 90% of these infants are born in developing countries. The applied low-cost rapid prototyping fabrication technology has the potential to provide a test that is affordable to medical systems of developing economies as well.