Transient fermentation experiments to analyze mixed substrate dynamics in Pichia pastoris

Abstract

Elementares Prozessverständnis ist in der Entwicklung biotechnologischer Produktionsprozesse von höchster Wichtigkeit. Die frühe quantitative Charakterisierung der verwendeten Organismen ist daher eine der Schlüsselelemente für die erfolgreiche Entwicklung wissensbasierter Prozesse. Wichtige Parameter sind hierbei Aufnahmeraten, Produktbildungsraten, Wachstumsraten und Ausbeutekoeffizienten, da sie vom Experiment und von der Dimensionierung des Prozesses unabhängig sind. Ein weiterer interessanter Aspekt ist das Verhalten der Kultur während des Wachstums auf Gemischtsubstraten wie es zum Beispiel während der Induktion der rekombinanten Proteinproduktion der Fall ist.<br />In der vorliegenden Arbeit wurden Puls- uns Shiftexperimente mit Glycerin, Glucose, Malat, Pyruvat und Acetat in Chemostat Kulturen von Pichia pastoris durchgeführt, um die Adaptation zu höheren Wachstumsraten und das Verhalten unter Gemischtsubstratbedingungen quantitativ zu bestimmen. Hierzu wurden verschiedene on- und off-line Messmethoden wie Gasanalysatoren, HPLC und enzymatische Tests angewendet um den Prozessverlauf zu beobachten und als Eingangsvariablen für Massenbilanzen zu fungieren. Die Validierung der Ergebnisse sowie die Datenrekonzilierung erfolgten, zusammen mit einem statistischen Test über Elementarbilanzen.<br /> Die Resultate zeigten, dass dieser experimentelle und auswertetechnische Ansatz für transiente Experimente eine gute und einfache Methode für die Stammcharakterisierung im Bezug auf substratspezifische Effekte und das Erlangen eines ersten Überblicks über metabolische Mechanismen darstellt. Die gepulsten Substrate konnten hinsichtlich ihrer repressiven, additiven oder kompetetiven Eigenschaften als Gemischtsubstrate, möglicher toxischer Effekte, ihres Metabolismus hinsichtlich Biomasse- oder Energierzeugung, ihrem Einfluss auf das oxidative Wachstum, ihres Einflusses auf die Biomassezusammensetzung sowie der Regulationsebene ihrer Verwertung (Aufnahme oder Produktion von Metaboliten) charakterisiert werden.<br />Eine mögliche on- oder at-line Quantifizierung von Substraten und Metaboliten würde es, zusammen mit den angewendeten Methoden für die Ratenberechnug und Datenrekozilierung, überdies erlauben, die Biomassekonzentration aus einem einzigen Startwert on-line zu berechnen.<br />Eine Anwendung der gezeigten Methodik auf Zulaufverfahren (fed- batches) würde es außerdem ermöglichen zeitintensive kontinuierliche Kulturen zu umgehen und die Experimente unter realen Prozessbedingungen durchzuführen.

Fundamental process understanding is of utmost importance in the development of new biotechnological processes. The early quantitative characterization of possible production hosts is therefore one of the key elements to develop knowledge based processes. Important parameters are substrate uptake rates, production rates, maximum growth rates and yields, as they are independent from experiment and scale. But also the performance on mixed substrates, as they occur for example during induction of recombinant protein production, is of great interest. In the present work, pulse and shift experiments with glycerol, glucose, malate, pyruvate and acetate were performed in chemostat cultures of the methylotrophic yeast Pichia pastoris in order to quantitatively examine the adaptation to higher growth rates, as well as to quantify mixed substrate dynamics. Different on- and off-line methods such as gas analyzers, HPLC and enzymatic essays were used for a quantitative monitoring of the fermentation process and as input variables to mass balances. Elemental balances in combination with a statistical test for validation of the results were used for data reconciliation. The results show, that this approach of performing and exploiting transient experiments, turned out to be a good and easy method for strain characterisation when it comes to substrate specific effects and to get a first overview about metabolic mechanisms. The pulsed substrates could be characterized regarding their repressive, additive or competitive behaviour as mixed substrates, possible toxic effects, their metabolism towards energy or biomass production, their influence on oxidative growth, their influence on biomass composition as well as the stage of metabolic regulation (uptake or production of metabolites).<br /> Together with on- or at-line quantification of substrates and metabolites the applied methods for rate calculation and data reconciliation could even enable to indirectly determine the actual biomass concentration out of a single start value on-line. A possible application to fed-batches will allow to avoid time consuming continuous cultures and to perform experiments under real process conditions.<br />