N-glycan modification of recombinant factor IX : a novel approach for the polysialylation of therapeutic proteins

Abstract

Protein- und Peptidtherapeutika sind aus der modernen Medizin heutzutage nicht mehr wegzudenken. Obwohl diese Medikamentenklasse viele Vorteile gegenüber konventionellen Arzneimitteln hat, gibt es auch einige Unzulänglichkeiten, vor allem die schlechte Pharmakokinetik. Eine sehr gute Möglichkeit um diese Schwäche zu kompensieren besteht darin ein Polymer kovalent an den Wirkstoff zu koppeln um dadurch dessen positive Eigenschaften auf das Präparat zu übertragen.<br />Das Ziel dieser Arbeit war es eine neuartige Kopplungsstrategie für die chemische Modifizierung von rekombinanten Blutgerinnungsfaktoren zu entwickeln, im Speziellen Faktor IX gekoppelt mit Polysialinsäure. Durch solch ein chemisch modifiziertes Faktor IX-Derivat kann die Lebensqualität von Hämophilie B Patienten erheblich verbessert werden, weil dadurch eine effektive prophylaktische Therapie ermöglicht wird, wie sie zurzeit nicht erhältlich ist.<br />Das Ziel einer solchen Modifikation von Faktor IX sind die beiden im Aktivierungspeptid gelegenen N-Glykane. Diese Herangehensweise gestattet ein ,Drug-Design' bei dem das chemisch modifizierte Proenzym im Blutkreislauf zirkuliert und nach der Aktivierung das native unmodifizierte Enzym freisetzt. Während der Entwicklung eines solchen Hämophilie Präparates wurden verschiedene Arten der chemischen Modifizierung, sowie verschieden Reaktionsanordnungen und auch verschiedene chromatographische Aufreinigungsmethoden evaluiert.<br />Außerdem wurde die Polysialinsäure, welche zur Faktor IX-Modifikation verwendet wurde, in einer abgewandelten reduktiven Aminierung zu einem neuartigen aminooxy-funktionalisierten Polymer umgesetzt. Des Weiteren wurde der Einfluss eines nukleophilen Katalysators für die Konjugationsreaktion untersucht. Diese wissenschaftliche Arbeit zeigt die Realisierbarkeit der Herstellung eines Faktor IX-Polysialinsäure Präparats in Bezug auf zwei entscheidende Punkte. Zuallererst konnten durch dieses Verfahren Faktor IX-Derivate hergestellt werden, welche spezifische Aktivitäten von bis zu 63 % behielten und verbesserte Pharmakokinetik in verschieden Tiermodellen zeigten. Des Weiteren ermöglichte eine Aufreinigungsmethode, bestehend aus einem Anionentauscherschritt und einer Hydrophoben-Interaktionschromatographie, Proteinausbeuten von bis zu 73 % und Aktivitätsausbeuten von bis zu 48 %, was die industrielle Herstellung eines solchen Präparates überhaupt erst interessant macht.

Protein and peptide therapeutics are indispensible in modern medicine today. Despite their great therapeutic benefits this class of drugs suffers from several shortcomings, most importantly their poor pharmacokinetics. One of the most elaborate ways to compensate this weakness is the conjugation of a polymeric moiety like polyethylene glycol, dextran or polysialic acid, to the biopharmaceutical drug, thereby endowing it with all the favorable properties of the polymer. The objective of this work was to develop a novel conjugation strategy for the chemical modification of recombinant blood coagulation factors, in particular factor IX conjugated to polysialic acid. Such a modified factor IX derivative has the ability to substantially improve the quality of life of people suffering from hemophilia B by providing an effective prophylactic therapy, which is not available by now. The target of the modification within factor IX were the two N-glycans located on the activation peptide. This conjugation approach allows a drug design whereat the modified pro-enzyme is circulating in the blood stream and releases the active un-modified enzyme upon activation. During the development of such a hemophilia B therapeutic different conjugation chemistries (reductive amination, hydrazone- and oxime formation) targeted to oxidized N-glycans, various conjugation designs (sequential- and simultaneous reaction approach) and also diverse chromatographic purification procedures were evaluated. Additionally the polymer that has been used for the modification (polysialic acid oxidized at the non-reducing end) was derivatized in a modified reductive amination reaction creating a novel aminooxy-functionalized polymer. Furthermore the necessity of nucleophilic catalysts for the conjugation reaction was assessed. The present work demonstrates the feasibility for the preparation of a factor IX-polysialic acid conjugate with regard to two vital aspects. First and foremost, through the developed conjugation approach, that is a concomitant oxidation of factor IX and conjugation to polysialic acid in the presence of m-toluidine as innoxious nucleophilic catalyst, a factor IX derivative was prepared that retained up to 63 % of its specific activity and showed enhanced pharmacokinetics in various animal models. Secondly, the corresponding purification process, that is a 2-column method employing an anion exchange and a hydrophobic interaction chromatography step, yielded in product recoveries of up to 73 % of protein and up to 48 % of activity units, making industrial manufacturing feasible.