Synthesis of (late) phase II mycotoxin metabolites focused on the Fusarium mycotoxin zeralenone

Abstract

Zearalenon (ZEN) ist ein von etlichen phytopathogenen Fusarium Stämmen produziertes Mykotoxin. Es wird unter anderem von Fusarium culmorum und Fusarium graminearum gebildet. Fusarium Pilze befallen vorwiegend pflanzliche Güter, dadurch gelangen Mykotoxine wie ZEN in unsere Nahrungs- und Futtermittelkette. Vor allem Getreide und davon abgeleitete Nahrungsmittel sind häufig mit Zearalenon kontaminiert.<br />Da ZEN dem natürlichem Östrogen strukturähnlich ist, kann dieses an den Östrogenrezeptor binden und dabei zu Hyperöstrogenismus, Problemen im Fortpflanzungstrakt und zur Beeinträchtigung der Fruchtbarkeit führen.<br />Daher wurde viel Aufwand in die Entwicklung von Routinetests gesteckt und die Europäische Union legte maximal zulässige Grenzwerte fest. Allerdings neigen Pflanzen im Zuge der Abwehr von Fremdstoffen auch zur Verstoffwechslung dieser Fusarium Mykotoxine. Im späten Phase II Metabolismus treten Gentiobioside als wichtige Metabolite auf. Diese ZEN Konjugate werden den sogenannten "maskierten Mykotoxinen" zugeordnet.<br />Diese unterliegen weder gesetzlichen Richtlinien, noch werden sie bei Routineanalysen erfasst. Dennoch wird eine Gefährdung von Säugetieren vermutet, da während der Verdauung die ursprünglichen Giftstoffe wieder freigesetzt werden können. Weitere bioanalytische Untersuchungen erfordern die Bereitstellung von ZEN-14-ß,D-gentiosbiosid als Referenzmaterial und zur Evaluierung der Toxizität. Das vorrangige Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese von ZEN 14 ß,D gentiobiosid.<br />Gentiobioside sind entweder über einen direkten oder stufenweisen Ansatz zugänglich. Die direkte Glykosylierung erfordert die Herstellung eines Gentiobiosyl-, die stufenweise dagegen die Synthese eines Glucosyldonors, welcher nach der ersten Konjugation zu ZEN, in einen Akzeptor umgewandelt werden kann. In der Literatur sind mehrere Glykosylierungsmethoden beschrieben, allerdings meist ohne Empfehlungen welche Methode für bestimmte Aglycone, die geeignetste ist.<br />Um das Potential des direkten Ansatzes auszuloten, wurden verschiedene Gentiobiosyldonoren hergestellt und unter wechselnden Reaktionsbedingungen an ein ZEN Imitat konjugiert.<br />Das so erhaltene, optimierte Verfahren konnte anschließend zur Synthese von ZEN-14-ß,D-gentiobiosid herangezogen werden.<br />Weiters wurden 6-silylierte Glucosyldonoren hergestellt, die die Entwicklung eines vielseitigeren, stufenweisen Ansatzes ermöglichen und zur Synthese komplexerer Mykotoxin Konjugate der späten Phase II in naher Zukunft Verwendung finden sollen.<br />

Zearalenone (ZEN) is a mycotoxin produced by several plant pathogenic Fusarium species, including Fusarium culmorum and Fusarium graminearum. It is often released onto food and feed after growth of Fusarium fungi on plant commodities. Especially cereals and cereal-based food is often found to be contaminated by the mycotoxin zearalenone.<br />As the structure of ZEN resembles natural estrogens, it is able to bind to the estrogenic receptor causing hyperestrogenism, problems of the reproductive tract and impaired fertility. Thus it was taken much effort to develop routine tests for food samples and maximum levels were set by the European commission. However Fusarium mycotoxins are prone to metabolisation by plants. Infected plants are able to modify ZEN biochemically as part of their defense against xenobiotics. In the (late) phase II metabolism of plants gentiobiosides emerge as important metabolic products. These altered forms of ZEN belong to the broader group of so called "masked mycotoxins" that are neither recognized by routine screenings nor regulated by legislation. Nevertheless they are harmful for mammals as hydrolysis during digestion can convert masked mycotoxins back to their toxic precursors. Further investigations in terms of bioanalytics and toxicology demands provision of ZEN-14-ß,D-gentiosbioside as reference material. Therefore the major aim of this work was to synthesize ZEN-14-ß,D-gentiobioside.<br />Gentiobiosides can either be synthesized by a direct or stepwise glycosylation approach. Direct glycosylation requires the preparation of a gentiobiosyl donor. Stepwise glucosylation on the other hand demands the synthesis of glucosyl donors that, after initial conjugation onto ZEN, can be transformed into acceptors for the next glucosylation step.<br />Literature reveals a variety of methods for glycosylations, but knowledge of which method is the most beneficial for certain aglycones is scarce.<br />To investigate the scope of the direct approach two different gentiobiosyl donors were prepared and applied in glycosylation reactions of a ZEN mimic under various conditions to find an optimized protocol that was finally used for the preparation of the masked Fusarium mycotoxin, ZEN-14-ß,D-gentiobioside.<br />Furthermore 6-silylated glucosyl donors were pre-pared, required for the development of a more versatile, stepwise approach enabling the synthesis of more complex (late) phase II mycotoxin conjugates in the near future.<br />