Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zur Flavonoidbiosynthese in Onobrychis viciifolia

Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die biochemischen und molekularbiologischen Grundlagen zu schaffen, um mögliche Korrelationen zwischen dem Flavonoidmetabolismus und den beobachteten positiven Effekten der Esparsette (Onobrychis viciifolia) identifizieren zu können. Dadurch könnten Auswahlkriterien für eine optimale Flavonoidbiosynthese für ein zukünftiges Züchtungsprogramm festgelegt werden. Es wurden Methoden für die Gewinnung von Enzympräparationen, Gesamt-RNA und mRNA aus dem polyphenolreichen Pflanzenmaterial der Esparsette erarbeitet. Damit konnten die Aktivitäten der an der Flavonoidbiosynthese beteiligten Enzyme Phenylalaninammoniumlyase (PAL), Chalkonsynthase/Chalkonisomerase (CHS/CHI), Flavanon-3-Hydroxylase (FHT), Dihydroflavonol-4-Reduktase (DFR), Flavonolsynthase (FLS), Flavonoid-3-O-Glucosyltransferase (FGT) und O-Methyltransferase in verschiedenen Geweben der Esparsette nachgewiesen werden. In Keimlingen konnte außerdem die Aktivität einer Isoflavonsynthase (IFS) untersucht werden, die für die Bildung der für die Leguminosen charakteristischen Isoflavonoide notwendig ist. Die Enzyme wurden charakterisiert und Standardenzymtests etabliert. Darüber hinaus wurden die cDNA Klone von PAL, CHS, CHI, FHT, DFR, FLS, Leucoanthocyanidinreduktase (LAR), Anthocyanidinsynthase (ANS), Anthocyanidinreduktase (ANR), FGT, Isoflavon-O-Methyltransferase und Polyketidreduktase isoliert. CHS, FHT, DFR, FLS, LAR, ANS, ANR und IFS wurden durch heterologe Expression auf ihre Funktionalität und Substratakzeptanz getestet. Aufbauend auf der Charakterisierung der Enzyme und der Isolierung der cDNAs wurden 53 ausgewählte Linien auf ihre Enzymaktivität und Genexpression untersucht. Die Linien zeigten deutliche Unterschiede hinsichtlich der Enzymaktivität und Genexpression. Damit konnten im Bezug auf die Flavonoidbiosynthese besonders charakteristische Linien ausgewählt werden, die für eine systematische Evaluierung des Beitrags der Flavonoide zu den positiven Eigenschaften der Ersparsette herangezogen werden können.

The aim of the present work was to establish the biochemical and molecular biological basis for the identification of possible correlations between flavonoid metabolism and the observed positive effects of sainfoin (Onobrychis viciifolia). This selection criteria for an optimal flavonoid biosynthesis could thereby be predefined for future breeding programmes. Methods were developed for the preparation of enzymes, total RNA and mRNA from the polyphenol rich plant material of sainfoin. The activities of the following enzymes involved in the flavonoidbiosynthesis, in different tissues were demonstrated: phenylalanine ammonia lyase (PAL), chalkone synthase/chalkone isomerase (CHS/CHI), flavanone 3-hydroxylase (FHT), dihydroflavonol 4-reductase (DFR), flavonol synthase (FLS), flavonoid 3-O-glucosyltransferase (FGT) and O-methyltransferase. In addition, of isoflavone synthase activity (IFS) was determined in seedlings. IFS is essential for the formation of the isoflavonoids, which are typically found in legumes. All enzymes were characterized in detail and standard enzyme tests were established. Furthermore cDNA clones of PAL, CHS, CHI, FHT, DFR, FLS, leucoanthocyanidine reductase (LAR), anthocyanidin synthase (ANS), anthocyanidin reductase (ANR), FGT, isoflavone-O-methyltransferase and polyketide reductase were isolated.<br />CHS, FHT, DFR, FLS, LAR, ANS, ANR and IFS were tested for functional activity by heterologous expression and their substrate acceptance was studied. Based on the characterization of the enzymes and the isolation of the cDNAs 53 selected lines were screened for their enzymatic activity and quantitative gene expression. The lines showed distinct differences with respect to enzyme activity and gene expression. These can be used for the systematic evaluation of the flavonoid's contribution to the benefits of sainfoin.