Complex formation between blood coagulation Factor VIII and von Willebrand Factor investigated by Atomic Force Microscopy

Abstract

Mithilfe einer neuen Strategie zur Beobachtung von Proteinreaktionen auf einzelmolekularer Ebene mit AFM Mikroskopie wurde die Bildung von VWF-FVIII-Komplexen (von Willebrand Faktor bzw. Faktor VIII) gezeigt. Die Reaktion wurde mit rekombinantem, auf Glimmer immobilisiertem, VWF und rekombinantem FVIII in PBS Lösung (phosphate buffered saline) durchgeführt. Der hier beschriebene Zugang ermöglicht es, Bilder vom identischen Molekül vor und nach der Komplexbildung aufzunehmen. Dieses System lässt sich besonders schwer mit bildgebenden Methoden untersuchen, da sich die globulären FVIII Moleküle in Form und Größe nicht von den globulären VWF Einheiten unterscheiden. Dies macht es unerlässlich die Form eines Moleküls während der Komplexbildung so stabil zu halten, dass jeder Knotenpunkt vor und nach der Reaktion verglichen werden kann. Dazu wurde die Haftung von VWF auf Glimmer unter Flüssigkeit optimiert. Es wurde gezeigt, dass das FVIII : VWF-Monomer Verhältnis bis zu 1 : 4 betragen kann.<br />Mit einem eigens konstruierten Mikroströmungsgerät wurden teilweise und vollständige Streckungen von VWF erreicht. Basierend auf diesen Vorbedingungen wurde gezeigt, dass gestreckter VWF keinen FVIII binden kann.<br />

The formation of a VWF-FVIII-complex (von Willebrand Factor and Factor VIII) is demonstrated by AFM imaging using a new strategy to follow protein reactions on the single molecule level. The reaction is performed with a recombinant VWF immobilized on a mica surface and a recombinant FVIII dissolved in PBS (phosphate buffered saline). Our approach allows to obtain an image of exactly the same molecule before and after the complex formation. This system is particularly difficult to study by imaging because the globular FVIII molecules do not differ significantly from the globular units of VWF in size, and thus it is necessary to maintain the position of the VWF chain during the complex formation as much as possible in order to compare every individual globular domain before complex formation and thereafter. For this purpose the adhesion of VWF on mica in the presence of a buffer liquid has been optimized. We show that the FVIII binding capacity of VWF can be as high to reach a FVIII : VWF-monomer ratio of 1 : 4.<br />Total and partial shear induced stretching was achieved with a specially constructed microfluidic device.<br />Basing on this precondition it was shown that stretched VWF is not able to bind FVIII.<br />