Entwicklung und Evaluierung eines Multi-Elektroden-Array basierten Impedanzanalysesystems zur in vitro Untersuchung von Zellwachstum und Permeabiltität von Zellschichten

Abstract

Für die Untersuchung von zellulären Vorgängen oder Erkrankungen werden im biologischen und medizinischen Bereich zerstörungsfreie Analysemethoden benötigt, welche bei unver-änderten physiologischen und morphologischen Eigenschaften der Zellen eine kontinuierli-che Messung lebender Zellen erlauben. Einer dieser Methoden ist die Impedanzspektrosko-pie, welche ohne Verwendung von Markersubstanzen direkt, und nichtinvasiv die dielektrischen Eigenschaften der Zelle messen kann. Mit dieser elektrischen Messmethode kann beispielsweise der Unterschied der Zellwachstumsgeschwindigkeit von Krebszellen und gesunden Zellen bestimmt werden.<br />In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiges System zur simultanen Messung der Impe-danz von vier adhärenten Zellkulturen entwickelt. Dazu wird ein Zellimpedanzchip mit vier mikrostruktuierten sog.<br />Interdigitated Electrodes (IDE) entwickelt, um in vier selbstgefertig-ten, separaten, in vitro Zellkulturkammern das Caco-2 Zellwachstum sowie die Permeabilität einer konfluenten Caco-2 Zellschicht zu messen.<br />Basierend auf dem Design von kommerziellen Multielectrode Array Sensorchips bestehend aus einem 49 mm x 49 mm großem Glassubstrat mit 60 Anschlusskontakten an den Seiten wurde eine neuartige, planare, basolaterale IDE Elektrodenkonfiguration entworfen. Der aus flexiblen Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellte Zellkulturkammeraufsatz mit den vier Zellkulturkammern wird über die IDE Elektroden entweder manuell platziert, oder hochprä-zise unter einem mikroskopischen System mit Mikrostelltischen ausgerichtet und positio-niert.<br />Für Langzeit-Impedanzmessungen wurde zur kontrollierten Steuerung des Impedanzmessge-rätes sowie zur Datenspeicherung eine Mess- und Steuerungssoftware In Labview (National Instruments) implementiert.<br />Dadurch konnte ein vollautomatisierender Messablauf und eine Fernwartung per Internet während des Versuches durchgeführt werden.Dieser vollautomati-sierter Impedanzmessaufbau erlaube die Untersuchung des Wachstums von bis zu vier Zell-kulturen in einem Inkubator unter sterilen Bedingungen.<br />Als Zellkulturen wurden humane Caco-2 Zellen verwendet, welche Eigenschaften von Darmepithelien aufweisen und für pharmazeutische Transportstudien von großem Interesse sind.<br />Die Ergebnisse der Zellwachstumsuntersuchungen belegen einerseits, dass in der selbstge-fertigten PDMS Zellkulturkammer Caco-2 Zellen unter definierten Umgebungsbedingungen überlebensfähig sind, und anderseits, dass das Zellwachstum elektrisch, mit hoher Empfind-lichkeit gemessen werden kann. Das Positionierung des Zellkulturkammeraufsatzes mit Hilfe des mikroskopischen Ausrichtungssystems ermöglicht einen besseren Vergleich des Wachs-tums in den Zellkulturkammern untereinander.<br />Die Permeabilitätsstudien der zuvor gewachsen Caco-2 Zellschicht wurden unter Einwirkung des Bromelains, einer Substanz welche die Durchlässigkeit von Zellschichten steigert, durch-geführt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, dass der Einfluss des Bromelains, und die damit verbundene Lockerung der Zellkontakte, bei korrekter Dosierung detektiert wer-den kann.<br />Mit der entwickelten vollautomatisierten Bioimpedanzmessung steht ein neues Analysesys-tem zur Verfügung, welches kompatible mit einer Vielzahl an kommerziell erwerblichen Analysechips (z.B. Multi Elektroden Arrays) ist.<br />Eine erste Anwendung für pharmazeutische Transportstudien wurde erfolgreich mit Bromelain demonstriert und zeigt die weiteren vielfältigen Einsatzmöglichkeiten des entwi-ckelten Systems auf.<br />

For the study of cellular processes or diseases in biology and medicine non-destructive de-tection systems are required, which leave the physiological and morphological properties of the cells unchanged.<br />One of these methods is the impedance spectroscopy, which measures directly, label-free and non-invasively the dielectric properties of the cell and thus for exam-ple the difference of the cell growth velocity of cancer cells and healthy cells.<br />In this work a novel system for simultaneous measuring the impedance for adherent cells was developed. Thus a cell-impedance-chip is equipped with four micro structured so-called inter-digitated Electrodes (IDE) to measure the Caco-2 cell growth as well as the permeability of confluent Caco-2 cell-monolayers in four self-made, individual, in vitro cell culture chambers Based on the multielectrode array design(MEA) consisting of a 49 mm x 49 mm glass sub-strate with 60 solder contacts on the sides, a novel designed, planar, basolateral IDE-electrode configuration was designed.<br />The flexible polydimethylsiloxane (PDMS) cell culture chamber-cap with his four cell culture chambers is placed over the IDE electrodes, either manually or with the aid of a microscope alignment system.<br />In order to control the impedance measurement device and the data storage a measure-ment and control software for longtime impedance analysis is implemented in Labview (National Instruments). This enabled a full automated measurement process and a remote maintance during the experiment. This fully automated impedance measurement set-up allowed the investigation of the growth up to four cell cultures in an incubator under sterile conditions. Human Caco-2 cells cultures were used, which exhibit properties of intestinal epithelial cellsand are of great interest for pharmaceutical transport studies.<br />The results of cell growth studies have shown that on the one hand Caco-2cells are able to survive under specified environmental conditions in the self-made PDMS cell culture cham-ber and on the other hand the cell growth can be electrically and sensitively measured. The alignment with the aid of the microscope alignment system allows a better comparison of the growth in cell culture chambers with each other.<br />The permeability analysis of the previously grown Caco-2 cell layer was carried out under the influence of the permeation enhancer bromelain.<br />The investigations-results show that the influence of bromelain, and the consequent loosening of cell contacts, can be detected at correct dosage.<br />With the developed fully automated bio-impedance analysis a novel system is available that is compatible with a variety of commercial available analytical chips.<br />An initial application for pharmaceutical transport studies has been demonstrated success-fully with bromelain, which shows the diverse applications of the developed system.<br />