Microstructured impedance system for contactless in vitro monitoring of silver nanoparticle cytotoxicity

Abstract

In den letzten zehn Jahren ist die Verwendung von Nanomaterialien in industriellen und medizinischen Anwendungen enorm gestiegen. Nanopartikel (NP) werden in Medizin und Biologie als antimikrobielle Wirkstoffe, Arzneistoffträger, Kontrastmittel und fluoreszierende sowie magnetische Marker verwendet. Dadurch ist der Mensch einer steigenden Anzahl an unterschiedlichen Nanopartikeln ausgesetzt. Diese Situation schafft eine dringende Notwendigkeit für schnelle und zuverlässige Untersuchungsverfahren um das Gefährdungspotential von Nanomaterialien zu erkennen.<br />Klassische, so genannte zellbasierte Endpunktdetektionsassays, liefern nur begrenzt zuverlässige Fluoreszenzsignale, da Interaktionen zwischen dem Farbstoff und der katalytischen Oberfläche von NP auftreten können.<br />Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein nicht-invasives Messsystem entwickelt, welches auf kontaktloser, elektrischer Zell-Substrat-Impedanzmessung basiert und die Reaktion der humanen Zellen in An- und Abwesenheit von NP untersucht. Menschliche Hautfibroblasten (NHDF) wurden verwendet, da sie die Struktur des Bindegewebes aufrechterhalten und kontinuierlich Kollagen als Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix expremieren. Im Gegensatz zur klassischen Impedanzspektroskopie wurden die Sensorelektroden durch eine dünne Dielektrikumsschicht passiviert. Der Elektronenübertritt wurde durch eine Schicht Zirkoniumoxid, Titanoxid oder Siliziumnitrid verhindert, so dass elektrochemische Reaktionen auf der Metallelektrode ausgeschlossen werden konnten. Der Einfluss der Passivierungsschicht auf die Sensorempfindlichkeit wurde simuliert und Schichten unterschiedlicher Dielektrizitätskonstante wurden hinsichtlich ihrer elektrischen Isolierung und Biokompatibilität untersucht.<br />Simulationen und Experimente zeigten, dass die Sensitivität bei der Verwendung von High-K Materialien steigt und mit abnehmender Dicke der Passivierungsschicht ebenfalls zunimmt.<br />In der vorliegenden Arbeit wurde erfolgreich demonstriert, daß das kontaktlose Impedanzmesssystem eine mögliche toxische Wirkung von Silber-NP auf primäre humane Zellen unter Zellkulturbedingungen erkennt.<br />Das Vermögen von Fibroblasten Kollagen zu expremieren wird als Indikator für die toxische Wirkung der NP auf die Zelle vorgeschlagen. Ergebnisse der Untersuchung haben gezeigen, dass die Fähigkeit der NHDF Kollagen zu synthetisieren in Anwesenheit von niedrigen Nanosilberkonzentrationen stark reduziert ist.<br />

During the last decade the usage of engineered nanomaterials in industrial and medical applications has enormously increased.<br />Nanoparticles (NP) are used in medicine and biology as anti-microbial agents, therapeutics, drug carriers, contrast agents, and fluorescent or magnetic labels. As a result humans are increasingly exposed to a large amount of different nanoparticles. This situation creates an urgent need for rapid and reliable screening procedures to identify the hazardous potential of engineered nanomaterials.<br />However, classical cell based assays based on optical/fluorescent endpoint detections have shown limited reliability due to interferences of the employed dyes with the catalytic surfaces of NP. For that purpose a label-free, non-invasive measurement system based on contactless electric cell-substrate impedance sensing (cECIS) has been developed and applied to study mammalian cell reactions in the absence and presence of NP. Normal human dermal fibroblasts (NHDF) were used, as they maintain the structure of connecting tissue and continuously express collagen, a protein macromolecule, as a main part of the extracellular matrix.<br />In contrast to classical impedance spectroscopy the sensor electrodes were passivated by a thin layer of a dielectricum. A layer of zirconium oxide, titanium oxide and silicon nitride on top of the electrode prevents any electron flow so that electrochemical reactions of the metal electrodes can be totally excluded. The influence of the passivation layer on the sensor sensitivity was simulated and different dielectric layers were investigated regarding their electrical insulation and biocompatibility. Simulations and experiments show that the sensitivity increases when using high-K materials and with decreasing passivation layer thickness.<br />In the presented work the ability of the contactless impedance measurement system to detect a potential toxic impact of silver NP on primary human cells under cell culture conditions has been successfully demonstrated. The ability of NHDF to produce collagen is proposed as an indicator for toxic influence on the cell. Results of the study show that the ability of NHDF to synthesize collagen is severely reduced in the presence of low nanosilver concentrations.