Identification of polymorphic molecular markers for rapid subtyping of different pathogenic bacterial strains

Abstract

Molekulare Marker spielen eine wichtige Rolle bei der Identifizierung und Charakterisierung von pathogenen Mikroorganismen.<br />Daher wurden im Verlauf dieser kummulativen Dissertation verschiedene molekulare Typisierungsmethoden, wie die Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM), Plasmidtypisierung, Analyse von Resistenzgenen oder amplified fragment length polymorphism (AFLP) hinsichtlich ihrer Fähigkeit verschiedene pathogene Bakterienstämme rasch zu identifizieren, getestet.<br />Die erste Studie beschreibt die Entwicklung und Evaluierung eines HRM Verfahrens zur Identifizierung häufiger Salmonellen Serotypen. Aufgrund serotyp-spezifischer Punktmutationen (single-nucleotide polymorphisms; SNPs) in jeweils einem charakteristischen Bereich der Gene fljB, gyrB und ycfQ konnte eine HRM, basierend auf der simultanen Amplifizierung und Denaturierung der jeweiligen Sequenzabschnitte etabliert werden.<br />Zusätzlich wurde eine real-time PCR zur spezifischen Detektion und Identifikation des häufigsten Serotyps (Salmonella serotype Enteritidis) entwickelt. Mit Hilfe dieser beiden Methoden konnten von 46 getesteten Salmonellen Serotypen insgesamt 39 Serotypen eindeutig charakterisiert werden.<br />Die zweite Studie beschäftigt sich mit der schnellen Differenzierung von multiresistenten Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) Isolaten von nicht multiresistenten Mycobacterium tuberculosis (non-MDR-TB) Isolaten.<br />MDR-TB Isolate sind per Definition resistent gegen die beiden Anti-Tuberkulose-Medikamente Isoniazid und Rifampicin. Diese Resistenz kann größtenteils auf SNPs innerhalb des rpoB Gens zurückgeführt werden.<br />Durch die HRM Analyse zweier unterschiedlicher Sequenzabschnitte des rpoB Gens konnten 47 von 49 MDR-TB Isolate und alle 19 non-MDR-TB Isolate als solche identifiziert werden. Die dritte hier präsentierte Studie beschäftigt sich mit der Etablierung einer HRM zur Detektion von SNPs im rpoB Gen von Clostridium difficile.<br />Punktmutationen, innerhalb des rpoB Gens und die daraus folgenden Aminosäure Substitutionen können zu einer reduzierten Rifaximin Empfindlichkeit führen. Rifaximin, ein Rifamycin Derivat ist ein vielversprechendes Medikament zur Behandlung wieder auftretender C.<br />difficile Infektionen. Mittels HRM Analyse einer vorgeschlagenen hot-spot Region innerhalb des rpoB Gens war es möglich 68 von insgesamt 70 getesteten C. difficile Isolaten mit reduzierter Rifaximin Empfindlichkeit von 278 nicht resistenten Isolaten zu unterscheiden.<br />Im Laufe der vierten Studie wurden 55 Penicillin resistente Escherichia coli (extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E. coli isolates) Isolate mittels molekularbiologischer Methoden charakterisiert und typisiert. Alle 55 Isolate hatten ein beta-Lactamase Gen der CTX-M Gruppe I. Fünf Isolate produzierten zusätzlich ESBL Enzyme der CTX-M Gruppe II und neun Isolate Enzyme der CTX-M Gruppe IV. Außerdem, konnten Enzyme des TEM Typs in drei Isolaten und des PSE Typs in einem Isolat nachgewiesen werden. Eine mittels plasmid replicon typing (PBRT) durchgeführte Typisierung der Plasmide detektierte acht verschiedene Plasmid Profile unter den 55 Isolaten. Zusätzlich wurden alle 55 Isolate mittels AFLP subtypisiert. Mit Hilfe der AFLP Analyse konnten insgesamt 20 verschiedene AFLP Bandenmuster generiert werden, wodurch es möglich war die 55 E. coli Isolate in 20 verschieden AFLP Typen einzuteilen (A-1 - A-20). Um den Typisierungsprozess in Zukunft zu beschleunigen wurden insgesamt 14 AFLP Typ spezifische DNS Fragmente isoliert und sequenziert. Jedoch konnte keine Korrelation zwischen AFLP Typ, ESBL Typ oder Plasmid Profil erkannt werden.<br />Die Ergebnisse aller vier Studien zeigen deutlich das hohe Potenzial molekularer Marker für die schnelle Identifizierung von pathogenen Bakterienstämmen.<br />

Molecular markers, representing polymorphisms on DNA level play an important role in the identification and characterization of pathogenic bacterial strains. Different molecular subtyping methods, including high-resolution melting (HRM) curve analysis, amplified fragment length polymorphism (AFLP), multilocus sequence typing (MLST), characterization of antibiotic resistance mediating genes, and plasmid replicon typing (PBRT) were investigated for their usefulness in strain subtyping in four different studies.<br />The first paper evaluates the potential of HRM to identify isolates of frequent Austrian Salmonella enterica serotypes which are one of the most important food-borne pathogens. Based on serotype-specific single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in fragments of fljB, gyrB and ycfQ a triplex gene scanning assay was developed for serotype-specific subtyping. Additionally, a PCR assay specific to the Salmonella serotype Enteritidis difference region I, for the unambiguous identification of the most frequent Austrian serotype, S. Enteritidis, was established.<br />Within a pool of 46 different serotypes, 39 serotypes could be clearly characterized by the developed triplex HRM curve assay, when applied in combination with the S. Enteritidis-specific real-time PCR assay.<br />The second paper deals with the fast differentiation of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) isolates, which are resistant to at least the two major anti-tuberculosis drugs (isoniazid and rifampicin), from non multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis (non-MDR-TB) isolates based on the detection of SNPs in rpoB using HRM. HRM analysis of a fragment of the rpoB cluster I of 49 MDR-TB and 19 fully susceptible non-MDR-TB isolates allowed the correct identification of 44 of the 49 MDR-TB isolates and all non-MDR-TB isolates. Three of the five MDR-TB isolates initially falsely identified as non-MDR-TB could be specifically detected through a second HRM assay targeting a SNP located outside the rpoB cluster I. The combined HRM analysis of all investigated isolates allowed the correct identification of 47 of the 49 MDR-TB isolates and of all non-MDR-TB isolates.<br />The third paper describes the applicability of HRM to identify Clostridum difficile isolates showing reduced susceptibility to rifaximin, an antibiotic for the treatment of recurring C. difficile infections, due to point mutations in rpoB. Gene scanning of a proposed hot-spot region within rpoB was performed on 70 isolates with reduced susceptibility to rifaximin and on 278 isolates showing full susceptibility to rifaximin. The HRM assay allowed the correct allocation of 68 of the 70 rifaximin resistant C. difficile isolates and of all non-resistant isolates. In the fourth paper, 55 extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Escherichia coli clinical isolates were analyzed by molecular methods. Analysis of the beta-lactamase genes revealed that all 55 isolates harboured a beta-lactamase gene of the CTX-M group I. In addition, five isolates harboured ESBL's of the CTX-M group II, nine isolates enzymes of the CTX-M group IV, three isolates enzymes of the TEM type, and one isolate carried an ESBL of the PSE type.<br />Characterization of the plasmids by PBRT detected eight different plasmid profiles among the 55 isolates. Furthermore, molecular subtyping of the isolates was performed by AFLP analysis. Twenty different AFLP types were found among the 55 isolates tested. For a further simplification of the subtyping process 14 AFLP type-specific DNA fragments were isolated, re-amplified and sequenced for subsequent development of a simple multiplex PCR protocol. However, a correlation between AFLP type, ESBL type and plasmid profile could not be found.<br />The results of all four different studies clearly indicate the high potential of molecular markers for the fast identification of pathogenic bacterial strains.<br />