Bioethanol aus Weizenstroh - von der Enzymproduktion bis zur Fermentation des Hydrolysats

Abstract

Ethanol als Treibstoff für Fahrzeuge wird derzeit großtechnisch bzw. kommerziell fast ausschließlich aus auf Stärke und Saccharose basierenden Rohstoffen gewonnen. In den letzten 10 Jahren stieg die Ethanol- und Biodieselproduktion weltweit um 10% pro Jahr an. Die Hauptproduzenten von Ethanol sind Brasilien (Zuckerrohr) und die USA (vorrangig aus Mais), mit 10 bzw. 13 Billionen Gallonen pro Jahr (Bioethanol der ersten Generation). Die Produktion von Ethanol aus lignocellulosehaltiger Biomasse (Bioethanol zweiter Generation), wie zum Bsp. aus Getreidestroh, befindet sich großteils in der Testphase bzw. im Pilot- oder Demonstrationsmaßstab. Die vorliegende Arbeit beschreibtt den Weg der Ethanolherstellung beginnend bei der Produktion der notwendigen Enzyme (Cellulase, Xylanase) für die enzymatische Hydrolyse der Cellulose und Hemicellulose bis hin zur Fermentation des gewonnenen Hydrolysats mit rekombinanten Hefen zu Ethanol. Die Einleitung stellt den derzeitigen Stand der Technik der Bioethanolgewinnung der ersten und zweiten Generation dar. Das für diese Arbeit eingesetzte Weizenstroh wurde vom "Technologie und Dienstleistungszentrum Ennstal" mittels eines Dampfexplosionsverfahrens vorbehandelt. Die Zusammensetzung des vorbehandelten Strohs war wie folgt: 30% Glukose, 10% Xylose, 0.7% Arabinose, 4.5% Asche und 21.5% Lignin. Die Cellulaseproduktion erfolgte mit dem Pilz Trichoderma reesei SVG 17, einer Mutante der QM 9414. Die Kultivierung erfolgte direkt mit dem vorbehandelten Weizenstroh als Kohlenstoffquelle, dabei wurden zwei Batch- und drei Fed-Batch-Versuche in einem Laborfermenter durchgeführt.<br />Beim Batch-Verfahren wurde eine Cellulaseaktivität von 1.3 FPU/ml erreicht. Mittels einer zweistufigen Fed-Batch-Strategie konnte die Aktivität der Enzyme auf 1.7 FPU/ml gesteigert werden. Das so gewonnene Enzymsystem wurde für die enzymatische Hydrolyse des vorbehandelten Weizenstrohs eingesetzt. In insgesamt 11 Versuchsreihen mit 65 Schüttelflaschenversuchen wurde die enzymatische Hydrolyse des Weizenstrohs optimiert. Das vorbehandelte Weizenstroh wurde direkt, ohne weitere Zerkleinerung und ohne oberflächenaktive Substanzen (PEG, Tween 80) für die Hydrolyseversuche eingesetzt. Ziel war es, die Versuche möglichst praxisrelevant zu gestalten. Vorrangig wurde dabei der Einfluss der [beta]-Glucosidase näher untersucht. In Abhängigkeit der Hydrolysezeit und unter der Forderung, dass ein Mindestglukoseertrag von 90% erreicht werden soll, ist folgende Enzymbeladung notwendig: 24h - 20 FPU/g TM; 23 CBU/g TM; 48h - 13 FPU/g TM; 22 CBU/g TM; 72h - 11 FPU/g TM; 13 CBU/g TM.<br />Das Hydrolysat der enzymatischen Hydrolyse wurde direkt - ohne Detoxifikation - mit den rekombinanten Hefestämmen BP000, BP10001 und IBB10A02 fermentiert. Dabei wurden das Wachstum der Hefe und die Ethanolproduktion näher untersucht. Der dabei erreichte Ethanolertrag, bezogen auf den Gesamtzuckerumsatz, betrug ca. 0.31g/g für den Stamm BP000 und ca. 0.35g/g für die beiden Stämme BP10001 und IBB10A02.<br />Bei der Wachstumsuntersuchung der drei rekombinanten Hefestämme auf 80% Hydrolysatanteil wurde die höchste spezifische Xyloseaufnahmerate zwischen 20 und 48 Stunden Fermentationslaufzeit mit dem Stamm IBB10A02 erreicht, der Wert diesbezüglich lag bei 0.2g/(g.ZTG.h). Für die beiden anderen Stämme lag dieser Wert im gleichen Zeitraum bei ca.<br />0.1g/(g.ZTG.h).<br />In einer weiteren Versuchsreihe wurde das Wachstum des evolvierten Hefestamms IBB10A02 bei unterschiedlicher Hydrolysatkonzentration näher untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass bei niedrigerer Hydrolysatkonzentration (8%) bessere Ergebnisse erreicht wurden. Dies dürfte auf eine gewisse Toxizität des Hydrolysats und daher auf eine gewisse Inhibierung des Wachstums zurückzuführen sein.<br />

Ethanol - used as fuel for vehicles - is currently produced in a large scale mainly from raw material, which is based on starch and saccharose. During the last ten years the production of ethanol and biodiesel annually increased by 10%.<br />The main producers of ethanol are Brazil (sugarcane) and the USA (mainly corn) with 10 respectively 13 trillion gallons p.a. (first generation bioethanol). The production of ethanol from biomass containing lignocellulose (second generation bioethanol), for example from grain straw, is more or less still in the test phase or at a demonstration level.<br />The present work describes the method of producing ethanol, starting with the production of the enzymes (cellulase, xylanase), which are required for the enzymatic hydolyses of the cellulose and hemicellulose, up to the fermentation of the resulting hydrolyzate with recombinant yeast.<br />The introduction gives an overview of the present state of technology in the production of first and second generation bioethanol. The wheat straw, which was used for this work, was pretreated by means of a steam explosion process, performed at the "Technologie und Dienstleistungszentrum Ennstal". The pretreated straw consists of 30% glucose, 10% xylose, 0.7% arabinose, 4.5% ash and 21.5% lignin. The cellulase was produced by using the fungus Trichoderma reesei SVG 17, a mutant of the QM 9414. The cultivation was carried out by using the pretreated wheat straw as carbon source; the procedure was performed as two batch- and three fed-batch-experiments. The result of the batch-experiments was a cellulase activity of 1.3 FPU/ml. This could be improved by means of a two step fed-batch-strategy, with which the enzyme activity could be increased to 1.7 FPU/ml. The so produced enzymes were used for the enzymatic hydrolysis of the pretreated wheat straw. The process of the enzymatic hydrolysis was optimized within 11 test series comprising 65 experiments with shake flask. The pretreated wheat straw was used directly, without further cutting and without the application of surface active substances (PEG, Tween 80). It was the major objective to carry out the experiments with high practical relevance and to study the influence of the [beta]-glucosidase. Depending on the two factors - the time of hydrolysis and the necessity to get a minimum yield of glucose of 90% - the necessary loading of the enzymes was as follows: 24h - 20 FPU/g TM; 23 CBU/g TM; 48h - 13 FPU/g TM; 22 CBU/g TM; 72h - 11 FPU/g TM; 13 CBU/g TM.<br />The product of the enzymatic hydrolysis - the hydrolysate - was fermented directly and without detoxification with the recombinant yeast strains BP000, BP10001 and IBB10A02. By means of this process the growth of the yeast and the extend of the ethanol production were studied thoroughly. The obtained yield of ethanol - related to the total conversion of sugar - was approximatively 0.31g/g for the strain BP000 and about 0.35g/g for BP10001 and IBB10A02.<br />The experiments, which were performed to observe the growth of the recombinant yeast strains up to 80%, showed that the highest specific rate of xylose-uptake was reached within the time of fermentation between 20 and 48 hours. The result for IBB10A02 was about 0.2g/(g.ZTG.h), whereas the tests with the two other yeast strains delivered values of about 0.1g/(g.ZTG.h).<br />Further tests were made to examine the influence of the concentration of the hydrolysate on the growth of the evolved strain IBB10A02. It was observed that the results were better for a lower concentration (8% hydrolysate), what might be due to a possible toxicity of the hydrolysate and thus to a certain growth inhibition.