Analytics of native immunoglobulins

Abstract

Die molekulare Struktur der Immunglobuline erlaubt es ihnen, zwei Hauptaufgaben zu erfüllen: die hochspezifische Bindung von Antigenen und die Einleitung von Immunantworten durch Wechselwirkungen mit anderen körpereigenen Molekülen. Da die Datenlage zum natürlichen Zustand der Immunglobuline im Blut mangelhaft ist, war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, das Verhalten von Immunglobulinen verschiedener Klassen in nativen Elektrophoresesystemen zu untersuchen, um Einblick in ihre biologisch aktive Struktur in humanem Serum zu gewinnen.<br />Aufgereinigte Immunglobuline der Klassen IgA, IgD, IgM und IgG, sowie der G-Unterklassen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4, wurden analysiert und mit Ergebnissen von humanem Serum verglichen. Antikörper, die spezifisch für die schweren Ketten der verschiedenen Immunglobulinklassen, gegen die Fragmente IgG Fab und IgG Fc, sowie gegen das gesamte IgG-Molekül waren, wurden zur Detektion verwendet. Das Bindungsverhalten dieser Antikörper wurde zunächst durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen und anschließenden Western Blot charakterisiert. Zusätzlich wurde Blue Native (BN) PAGE angewendet und ein Protokoll für nativen Western Blot aus der Literatur adaptiert.<br />Die mittels BN-PAGE identifizierten Banden stimmten weitgehend mit jenen, die durch klassenspezifische Detektion der nativen Western Blots wiedergefunden wurden, überein. Es konnte gezeigt werden, dass aufgereinigte Immunglobuline aller untersuchten Klassen in mehr als einem strukturellen Zustand vorlagen. IgA und IgM zeigten zwei bis drei gut unterscheidbare Banden bei hohen (>700 kDa) Molekulargewichten, die auf die Anwesenheit freier oligomerer Isoformen schließen lassen. Im Gegensatz dazu erstreckte sich das Signal für IgG über einen Molekulargewichtsbereich von mehreren hundert kDa, wobei die Unterklassen Banden mit erhöhter Intensität innerhalb dieses Bereiches aufwiesen. IgD zeigte eine scharfe Bande unterhalb von 400 kDa, sowie weniger deutliche Banden bei höheren Molekulargewichten, die den Mustern von IgG1, IgG2 und IgG3 ähnelten. Aus den Beobachtungen wird geschlossen, dass IgG im Blut vorwiegend in komplexierter oder aggregierter Form, gebunden an eine Vielzahl unterschiedlicher Antigene, vorliegt. Es wird spekuliert, dass die Hauptbande von IgD dessen monomere Form repräsentiert, während diffuse höhermolekulare Signale ebenfalls der Bildung von Antigenkomplexen zugeschrieben werden.

The molecular structure of immunoglobulins enables them to cover two major tasks, i.e. the highly specific binding of antigens and the induction of immune responses by interaction with other endogenous molecules. Data on the state of immunoglobulins in blood under natural conditions are scarce, therefore the presented work aimed at investigating the behaviour of immunoglobulins of different classes in a native electrophoretic system, for gaining an insight into their true biological activities in human serum. Purified immunoglobulins of the classes IgA, IgD, IgM and IgG, as well as the G-subclasses IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, were analyzed and compared to evidence in human serum. Antibodies with specificities towards the different classes' heavy chains, the IgG Fab and Fc fragment, as well as the whole IgG molecule were used for detection.<br />Binding properties of detection antibodies were established by reducing and non-reducing SDS-PAGE and subsequent western blotting. Additionally, Blue-Native (BN) PAGE was employed and a native western blot protocol was adapted from literature. Congruence between band signals detected in BN-PAGE and bands recovered by class-specific detection after native western blot was very high. It could be shown that purified immunoglobulins of all analyzed classes were present in more than one structural state. IgA and IgM showed two to three well-resolved bands at high (>700 kDa) molecular weights (MW) suggesting free oligomeric isoforms. In contrast, the main signal obtained for IgG was spread over a MW range of several hundreds of kDa, whereas subclasses did exhibit bands of elevated intensities within said range. IgD displayed one band below 400 kDa, as well as more indistinct ones at higher MWs that resembled the patterns of IgG1, IgG2 and IgG3.<br />From these observations, it is concluded that IgG is predominantly present in the circulating blood in a complexed or condensed form, attached to a multiplicity of different antigens. The predominant band of IgD is speculated to represent its monomeric form and additional diffuse bands are also credited to formation of antigen complexes.