Development of a derivatization protocol for the determination of selected polar cereal metabolites by gas chromatography-mass spectrometry

Abstract

Fusarium graminearium ruft bei Pflanzen die zerstörerische Krankheit Fusariose hervor. Der Schimmelpilz infiziert ökonomisch wichtige Getreidesorten wie Weizen, Hafer, Roggen und Mais. Kenntnisse über Virulenzmechanismen könnten aufklären welche Effektoren dafür verantwortlich sind, dass die Pflanze dazu fähig ist, Fusarium Metabolite zu metabolisieren und zu entgiften. Ziel dieser Arbeit war es, die technischen Parameter einer Metabolic profiling Methode für ausgewählte polare Getreidemetaboliten, die eine Rolle in den Resistenz- und Entgiftungs-Stoffwechselwegen spielen dürften, zu optimieren. Für den Ansatz mittels Gas Chromatographie-Massen Spektrometrie war eine zweistufige Derivatisierung der polaren Metaboliten notwendig:<br />Methoximierung mit Methoxyamine (MOXTM) erzwingt die offenkettige Form der Monosaccharide und reduziert so die Anzahl der möglichen Isomere.<br />Silylierung mit N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (MSTFA) senkt die Polarität der Metaboliten und erhöht ihre Flüchtigkeit. Diese Arbeit fokusiert sich auf die Optimierung des Derivatisierungsprotokolls und der GC-MS Parameter für die Bestimmung ausgewählter Aminosäuren, Nukleinbasen, Organischer Säuren, Saccharide und Zuckeralkohole. Die endgültigen GC-MS Parameter waren ein Injektions Druck Puls von 7 psi, ein Temperaturgradient von 10 °C/min und eine Ionenquellentemperatur von 300 °C. Um für jede Probe dieselbe Silylierungszeit zu gewährleisten, war eine Online-Derivatisierung erforderlich. Die Proben wurden mit 60 µl MOXTM Reagenz bei 60 °C für 90 min methoximiert. Die methoximierten Metaboliten wurden mit 100 µl MSTFA bei Raumtemperatur für 60 min silyliert. Die verbesserte Methode erlaubt es, die Anwesenheit und die Konzentration von polaren Metaboliten in unterschiedlichen Getreide Kultivaren in unterschiedlichen Stadien der Infektion zu beobachten.<br />

Fusarium graminearium provokes a devastating plant disease called Fusarium Head Blight (FHB). It infects economically important small grain cereals, such as wheat, oat, barley, and maize. Knowledge about virulence mechanisms could elucidate, which effectors are responsible for the plant's ability to metabolize and detoxify Fusarium metabolites. The aim of this work was to optimize the technical parameters of a metabolic profiling method for selected polar cereal metabolites, which may play a role in plant resistance and detoxification pathways. For the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) approach, a two step derivatization of the polar metabolites was necessary: Methoximation with methoxyamine (MOXTM) enforces the open-chain form of monosaccharides and thus, reduces the number of possible isomers. Silylation with N-methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (MSTFA) lowers the polarity of the metabolites and increases their volatility. This study focused on the optimization of the derivatization protocol and the GC-MS parameters for the determination of selected amino acids, nucleobases, organic acids, saccharides and sugar alcohols. The final GC-MS parameters were an injection pressure pulse of 7 psi, a temperature gradient of 10 °C/min and an ion source temperature of 300 °C. To assure the same silylation time for every sample, online derivatization was required. The samples were methoximated with 60 µl of MOXTM reagent at 60 °C for 90 min. The methoximated metabolites were silylated with 100 µl MSTFA at room temperature for 60 min. The improved method will allow observing the presence and concentration of polar metabolites in different cereal cultivars at different stages of infection.