Trichoderma reesei; pantothenic acid; heterologous protein expression
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Abstract:
Pantothensäure bzw Vitamin B5 ist ein wichtiger Precursor für die Biosynthese von Coenzym A (CoA), das als Acylgruppenträger fungiert und u.a. am Auf- und Abbau von Kohlenhydraten und Fetten beteiligt ist. Im Gegensatz zum Aufbau der Pantothensäure ist über deren Abbau wenig bekannt. Im T. reesei Genom sind die für den Pantothensäureabbau notwendigen Gene in einem Cluster zusammengefasst, der auch noch einen Zn(II)2Cys6 Transkriptionsfaktor PAA1 und eine Permease PAP1 umfasst. Um den Einfluss des Transkriptionsfaktors PAA1 auf die Expression des Pantothensäureclusters aufzuzeigen, wurden die Expression der anderen 5 Gene in einem Stamm, der im Regulator deletiert ist, untersucht. Es zeigte sich, dass die Induktion dieser Gene durch Pantothensäure in Abwesenheit des PAA1 Regulators verloren geht, aber in einem Stamm in dem der intakte Regulator wieder eingeführt wurde, wiederhergestellt werden konnte. Die Funktion der Permease PAP1 wurde mittels einer Komplementationsassays der Saccharomyces cerevisiae Pantothensäure-Permease-Mutante fen2 untersucht. Die Einbringung des T. reesei paa1 in die fen2 Mutante, führte zur Aufhebung des Wachstumsdefektes des fen2 Stammes und bestätigte somit die Funktion der PAP1 als Pantothensäurepermease. Weiters wurden die 2 Enzyme der ersten beiden Schritte des Pantothensäureabbaus in E. coli exprimiert und über einen His Tag gereinigt. Die Pantothenase PAN1, welche für den Abbau der Pantothensäure zu Pantoat und ß-Alanin verantwortlich ist, wurde in Inclusion Bodies produziert und konnte erst nach Optimierung der Wachtsumsbedingungen in löslichen Zustand produziert werden. Die Pantoat 4-dehydrogenase PAN2, welche die Oxidation von Pantoat zu R-4-dehydropantoat katalysiert, hat ein Molekulargewicht von 27 kDa, KM(Pantoate) von 19,51 mM und eine vmax von 3,33 U/mg. In der vorliegenden Arbeit wurden somit weitere Bestandteile des Pantothensäureabbaus in T. reesei funktionell charakterisiert.
de
Pantothenic acid (Vitamin B5) is essential for life as a precursor for coenzyme A (CoA) biosynthesis. CoA functions as an acyl group carrier required for carbohydrate and fat metabolism. The biosynthesis pathway of pantothenate is already well documented in many bacteria, fungi and plants whereas the pantothenate catabolism is largely unknown. Genes involved in pantothenate catabolism are clustered in the Trichoderma reesei genome and include beside four metabolic enzyme encoding genes, a putative pantothenate permease PAP1 and a Zn(II)2Cys6 transcription factor PAA1. In this thesis the effect of the deletion of paa1 on the expression of the other genes of the cluster was studied. It was shown that in the absence of paa1 no induction could be observed. Induction of the genes was, however, restored in strains in which paa1 was reintroduced. The function of the putative pantothenate permease PAP1 was tested in a complementation assay. Therefore, the T. reesei pap1 was introduced into the Saccharomyces cerevisiae pantothenate permease mutant fen2. In these strains the growth defect of the fen2 mutants was abolished which showed that pap1 indeed encodes a pantothenate permease. The first two enzymes of pantothenate catabolism were expressed in E. coli and purified as His-Tag proteins. Pantothenase PAN1, which is responsible for the degradation of pantothenic acid to pantoate and ß-alanine, was mainly produced in inclusion bodies and could only be produced in soluble form after optimization of the growth conditions. Pantoat 4-dehydrogenase PAN2 which oxidizes pantoate to R-4-dehydropantoate, was produced in soluble form with a Mw of 27 kDa, KM (pantoate) of 19,51 mM and a vmax of 3,33 U/mg. With the present work further components of the novel pathway of pantothenate catabolism could be identified.
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Zusammenfassung in deutscher Sprache Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers
