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dc.contributor.advisorSpadiut, Oliver-
dc.contributor.authorKastenhofer, Jens-
dc.date.accessioned2021-04-20T08:31:57Z-
dc.date.issued2021-
dc.date.submitted2021-04-
dc.identifier.urihttps://doi.org/10.34726/hss.2021.79360-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.12708/17243-
dc.descriptionArbeit an der Bibliothek noch nicht eingelangt - Daten nicht geprüft-
dc.descriptionAbweichender Titel nach Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers-
dc.descriptionKumulative Dissertation aus sechs Artikeln-
dc.description.abstractEscherichia coli ist eines der gängigsten Expressionssysteme für rekombinante Proteine. Zu seinen Vorteilen zählen hohe Wachstumsraten, einfache genetische Manipulierung und geringes Kontaminationsrisiko. Ein signifikanter Nachteil ist jedoch, dass das Produkt intrazellulär akkumuliert. Während der Expression im Zytoplasma wird der Apparat für Proteinfaltung oftmals überladen, was zu physiologischem Stress und zur Bildung von unlöslichen Inclusion-Bodies führt. Obwohl durch unlösliche Expression hohe Produktivität und Reinheit erzielt werden können, bedarf die Aufreinigung von Inclusion-Bodies komplexer Solubilisierungs- und Rückfaltungsschritte. Um die Löslichkeit, Stabilität und Aktivität des Produkts zu verbessern, kann es durch die innere Membran in das Periplasma geschleust werden, indem eine entsprechende Signalsequenz angehängt wird. Translokation ist aufgrund der oxidativen Umgebung des Periplasmas besonders wichtig für die korrekte Faltung von Proteinen mit Disulfidbrücken. Dennoch werden periplasmatische Proteine durch die äußere Membran im Zellinneren gehalten und müssen durch Disruption der Zellhülle extrahiert werden. In aktuellen industriellen Verfahren geschieht dies durch komplette Zelllyse, was die Freisetzung von zytoplasmatischen sowie periplasmatischen Wirtsproteinen, DNA und Lipiden zur Folge hat. Diese Unreinheiten erschweren die folgenden Reinigungsschritte und führen somit zu einem Engpass im Downstream-Prozess. Diese Limitierung kann durch extrazelluläre Proteinproduktion überwunden werden. Außerdem kann diese den Übergang zu kontinuierlichen Prozessen mit E. coli erleichtern.Extrazelluläre Proteinproduktion kann zustande gebracht werden, indem die Durchlässigkeit der äußeren Membran selektiv erhöht wird und damit das Produkt in das Medium austritt (sog. „Leakiness“). Es gibt jedoch noch immer keine etablierten, industriell anwendbaren Methoden für selektive Extraktion periplasmatischer Proteine. Die Permeabilität der äußeren Membran kann allerdings auch im Upstream-Prozess erhöht werden. Durch Genmanipulation wurde bisher eine Reihe an Stämmen entwickelt, die permanente Leakiness aufweisen. Der Großteil dieser Systeme weist jedoch vermindertes Wachstum oder Viabilität auf und es gibt wenig Wissen darüber, wie Leakiness in solchen Stämmen kontrolliert werden kann. Ungeachtet der Methode zur Erhöhung der äußeren Membranpermeabilität kommt es oft zur gleichzeitigen Desintegrierung der inneren Membran, also zur Lyse. Daher werden Echtzeit-Methoden für differenziertes Monitoring der inneren und äußeren Membranpermeabilität benötigt, sowie Strategien um diese zu kontrollieren. Dies würde extrazelluläre Proteinproduktion im Sinne von Quality by Design ermöglichen.In dieser Dissertation wurden verschiedene Aspekte der extrazellulären Proteinproduktion mit E. coli untersucht.Die Literatur über vorhandene Methoden um die Zellintegrität von E. coli zu messen und zu kontrollieren wurde studiert und zusammengefasst. Während es kaum Berichte über Echtzeit-Monitoring von Leakiness und Lyse gibt, sind einige Technologien verfügbar, welche zu diesem Zweck eingesetzt werden könnten. Hinsichtlich der Kontrolle der Zellintegrität besteht die Hürde zur Umsetzung fortgeschrittener Methoden darin, dass mechanistisches Verständnis vom Einfluss der Prozessparameter auf die Zellhülle fehlt.Ein Pulsed-Electric-Fields-Verfahren wurde als neuartige Methode zur kontinuierlichen selektiven Extraktion von periplasmatischem Protein aus dem konventionellen Stamm E. coli BL21(DE3) untersucht. Es wurde gezeigt, dass dieser Prozess selektive Produktgewinnung bei geringer Lyse gewährleistet und damit eine vielversprechende Methode für industrielle Anwendungen ist.Weiters wurde der kürzlich entwickelte Stamm E. coli X-press auf seine Anwendbarkeit für extrazelluläre Proteinproduktion untersucht. Der Einfluss von Prozessparametern auf Wachstum, Produktivität, Leakiness und Lyse wurde analysiert. E. coli X-press zeigte hohe äußere Membranpermeabilität bei hoher Viabilität und stellt somit ein vielversprechendes System für extrazelluläre Produktionsverfahren dar. Zudem wurde die ökonomische und ökologische Auswirkung des X-press Stammes auf den frühen Downstream-Prozess untersucht und mit einem intrazellulären Prozess verglichen. Mittels Reinigungsexperimenten und Prozessmodellierung wurden Kosten und Ressourcenverbrauch geschätzt. Dadurch konnten die Vorteile der extrazellulären Produktion mit E. coli X-press für den Downstream-Prozess demonstriert werden.Zuletzt wurde die Anwendbarkeit zweier Methoden für Monitoring der Zellintegrität von E. coli untersucht. Einerseits wurde gezeigt, dass das Einsetzen von Leakiness mittels hochauflösender Dichtemessungen des Kulturmediums detektiert werden kann und diese Methode eine wertvolle Ergänzung in der Analysen-Toolbox ist. Zusätzlich wurde Attenuated-Total-Reflectance-Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie in Kombination mit chemometrischen Analysen als Monitoring-Methode getestet. Deren Potential sowie Vorbehalte für den Einsatz in E. coli-Kulturen wurden aufgezeigt.Das Wissen und die Methoden, die im Rahmen dieser Dissertation generiert wurden, tragen zu Verständnis und Kontrolle der Zellintegrität von E. coli bei und werden zukünftige Bioprozesse mit diesem Mikroorganismus erleichtern.de
dc.description.abstractEscherichia coli is among the most popular expression hosts for recombinant proteins as it offers several advantages, such as high growth rates, simple genetic manipulation and low risk of contamination. However, a major drawback is that the product accumulates intracellularly. During expression in the cytoplasm, the folding machinery is often overloaded, leading to physiological stress and the formation of insoluble inclusion bodies. Although high productivity and purity can be achieved by insoluble expression strategies, downstream processing of inclusion bodies entails complex solubilization and refolding procedures. To improve protein solubility, stability and activity, the product may be translocated through the inner membrane into the periplasm by adding an appropriate signal sequence. Due to the oxidative environment of the periplasm, translocation is particularly important for the correct folding of proteins containing disulfide bonds. Yet, periplasmic proteins are usually retained by the outer membrane and must be extracted by disrupting the cell envelope. In current industrial scenarios, this is done by complete cell lysis, which leads to the release of host cell protein (both periplasmic and cytoplasmic), DNA and membrane lipids. These impurities severely hamper subsequent purification steps and thus create a bottleneck in the downstream process. Extracellular protein production can overcome this limitation. Furthermore, it may facilitate the transition to continuous bioprocessing with E. coli.Extracellular protein production can be achieved by selective permeabilization of the outer membrane and consequent leakage of the product to the medium. However, there is still a lack of industrially applicable methods for selective extraction of periplasmic proteins. Outer membrane permeability may also be enhanced in the upstream process. Genetic engineering of the E. coli cell envelope has been employed for the construction of various mutants displaying permanent leakiness. However, most of these hosts display impaired growth or viability and there is limited knowledge on how to control leakiness during the cultivation of such strains. Regardless of the method for outer membrane permeabilization, disintegration of the inner membrane (i.e. lysis) often co-occurs. Thus, methods for rapid, differential monitoring of inner and outer membrane integrity are needed, as well as strategies to control leakiness. This would allow extracellular production scenarios aligned with the principles of Quality by Design. In this Thesis, several aspects of extracellular protein production with E. coli were investigated.The literature on available methods for monitoring and controlling E. coli cell integrity during the upstream process was studied and reviewed. While reports about real-time monitoring of leakiness and lysis are scarce, a variety of technologies exist that might be suitable for this purpose. Regarding the control of E. coli cell integrity, the implementation of advanced methods is still hindered by limited mechanistic understanding of the effect of process parameters on the cell envelope.Pulsed electric fields treatment was assessed as a novel method for continuous selective extraction of periplasmic protein from the conventional, “non-leaky” strain E. coli BL21(DE3). It was shown that this procedure yields selective product recovery while keeping lysis low. Thus, this method is promising for industrial applications.Moreover, the utility of the recently developed E. coli X-press strain for extracellular protein production was examined. The influence of process parameters on the host’s growth, productivity, leakiness and lysis was studied. E. coli X-press displayed high outer membrane permeability while maintaining viability, constituting a promising expression system for extracellular production scenarios. Furthermore, the ecological and economic impact of utilizing E. coli X-press on the early downstream process was analyzed and compared to an intracellular production process. Purification experiments were combined with process modeling to estimate costs and resource consumption. Thereby, the benefits of extracellular production with E. coli X-press for the downstream process were demonstrated.Finally, two methods were studied for their applicability to monitor E. coli cell integrity. On one hand, it was shown that high-resolution measurements of culture medium density can be used to detect the onset of leakiness presenting a valuable addition to the ensemble of monitoring techniques. In addition, in-line Attenuated-Total-Reflectance Fourier-Transform-Infrared spectroscopy in combination with chemometrics was assessed as a monitoring tool. The potential of this method as well as its limitations for use in E. coli cultivations were demonstrated.Overall, the knowledge and methods generated in this Thesis contribute to the understanding and control of E. coli cell leakiness and will aid future bioprocessing with this microorganism.en
dc.format123 Seiten-
dc.languageEnglish-
dc.language.isoen-
dc.subjectEscherichia colien
dc.subjectFermentationen
dc.subjectBioprozessmonitoringen
dc.titleExtracellular Recombinant Protein Production with Escherichia colien
dc.typeThesisen
dc.typeHochschulschriftde
dc.identifier.doi10.34726/hss.2021.79360-
dc.publisher.placeWien-
tuw.thesisinformationTechnische Universität Wien-
tuw.publication.orgunitE166 - Institut für Verfahrenstechnik, Umwelttechnik und technische Biowissenschaften-
dc.type.qualificationlevelDoctoral-
dc.identifier.libraryidAC16189063-
dc.description.numberOfPages123-
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dc.thesistypeDissertationen
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item.openairetypeHochschulschrift-
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item.fulltextwith Fulltext-
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item.grantfulltextopen-
item.languageiso639-1en-
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