Evaluation of the suitability of in vitro bioassays for the genotoxicity assessment of food contact materials

Abstract

Die toxikologische Sicherheitsbewertung von Lebensmittelkontaktmaterialien (LMKs) stellt, insbesondere für unbeabsichtigt eingebrachte Substanzen (NIAS), eine Herausforderung dar. Dabei kann es sich um eine Vielzahl an unbekannten Substanzen handeln, welche aus dem LMK in das Lebensmittel migrieren. Mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Screening werden so genannte „Forest of Peaks“-Chromatogramme generiert, bei welchen es zeit- und kostenintensiv ist, alle Peaks zu identifizieren und zu charakterisieren. Stattdessen wird der Ansatz verfolgt, chemische und biologische Methoden zu kombinieren und so den Effekt des Substanzgemisches festzustellen. Besonders genotoxische Substanzen sind hierbei von großem Interesse, da bereits kleinste Mengen ausreichen, um einen Effekt auszulösen. Des-halb sollen durch die Kombination chemischer und biologischer Methoden, mehr Informatio-nen über unbekannte Substanzen gewonnen werden und so das „Threshold of Toxicological Concern“ (TTC) Prinzip angewendet werden. Für diese Arbeit wurde eine Vielzahl von etab-lierten Genotoxizitätstests analysiert und für den Einsatz von LMK-Migraten analysiert und optimiert. Dies inkludierte eine umfangreiche Literaturrecherche, sowie direkte Optimierungsversuche im Labor. Außerdem wurden neue Testsysteme entwickelt und validiert, wie zum Beispiel mittels „High Content Screening“ (HCS) oder ein Reportergenbasierter Assay mit HepG2 Zellen. Zusätzlich wurden mit den Assays LMK-Migrate analysiert, um Matrix-Effekte nachzuweisen und die Funktionsfähigkeit der Assays, in Anwesenheit von komplexen Mi-schung, zu evaluieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass LMK-Migrate mit humanzellbasierten Testsystemen analysiert werden können, jedoch sind diese nicht in der Lage, genotoxische Substanzen in ausreichend niedrigen Konzentrationen zu detektieren. Der Einsatz der HepG2 Zellen zeigte jedoch auf, dass kein metabolisches Aktivierungssystem zugegeben werden musste, da die metabolische Aktivität der Zellen bereits ausreichend war. Bakterienbasierte Testsysteme wiederum, wiesen bessere Nachweisgrenzen auf, jedoch waren auch diese nicht ausreichend und konnten selbst durch Optimierungsversuche nicht entsprechend verbessert werden. Hierfür wurde der Ames Test in unterschiedlichen Formaten angewandt, welcher sich in der Literaturanalyse als vielversprechendster Assay, in Hinblick auf Nachweisgrenzen her-auskristallisiert hatte. Schlussendlich haben die Versuche gezeigt, dass die Kombination aus chemischen und biologischen Methoden zu einem Informationsgewinn führt. Jedoch müssen diese noch verbessert werden, um genotoxische Substanzen in niedrigen Konzentrationen nachzuweisen, sodass diese zuverlässig für die toxikologische Evaluierung von LMKs eingesetzt werden können.

The toxicological safety assessment of food contact materials (FCMs) is an ongoing challenge, especially for non-intentionally added substances (NIAS), as a variety of substances with un-known toxicological characteristics could migrate from the FCM into the foodstuff. For NIAS, a non-targeted gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) screening is usually applied and will lead to chromatograms with so called ‘forest of peaks’. Identifying and characterising every peak is considered to be unfeasible as it is time-intensive and laborious. Instead it is suggested to combine chemical analysis with in vitro bioassays, which allows an effect based testing approach, where the overall mixture of the substances can be tested. Therefore, the effect of the substance mix as a whole can be determined. Genotoxic substances are considered to be the most important, as already very small amounts might lead to an adverse health effect. Through the combination and analysis with in vitro bioassays, the threshold of toxicological concern (TTC) approach for unknown substances can be followed. In this thesis, commonly used genotoxicity assays were looked into in detail, both in the literature and in the laboratory, and optimised for the assessment of FCMs. Further, new approaches and novel testing systems, such as high content screening (HCS) and reporter gene assays, were analysed and validated for their application for FCM analysis. Finally, several FCM migrates were tested to determine any matrix effect and the assay’s ability to function properly in the presence of complex mix-tures. Overall, mammalian based systems performed well in the presence of FCM migrates, but lacked the ability to detect most genotoxic substances at sufficiently low concentrations. For this, HepG2 based tests were used, which showed to be independent of an exogenous metabo-lising system. The bacterial based system, namely the Ames test, showed to be superior, but optimisation experiments were not successful. In a nutshell, this thesis showed that the combi-nation of chemical and biological methods is a promising approach, but both have to be further improved to ensure low concentrations of genotoxic substances migrating from FCM into food-stuff can be detected.