Einfluss von nicht-parenchymalen Zellen auf das Wachstumsverhalten früher Stadien der Hepatokanzerogenese

Abstract

Das hepatozelluläre Karzinom zählt zu den häufigsten Krebstodesursachen. Die Krankheit entwickelt sich meist in chronisch entzündeten Lebern. Entzündung führt zu einer Aktivierung von nicht parenchymalen Zellen (NPC). Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit war es, den Einfluss von NPCs und deren Faktoren auf das Wachstums von (prä)neoplastischen Hepatozyten zu untersuchen.<br />Zu diesem Zweck wurden Ratten mit dem Kanzerogen N-Nitrosomorpholin (NNM) behandelt. In der Folge entwickelten sich (prä)neoplastische Hepatozyten, die aufgrund ihrer spezifischen Expression der plazentaren Glutathion-S-Transferase detektiert werden können (GSTp+). 21 Tage nach NNM-Behandlung wurden die Hepatozyten durch Kollagenaseperfusion aus der Leber isoliert. Anschließend wurden sie als konventionelle Kulturen (Hep-conv) die NPCs enthalten oder als aufgereinigte, NPC-arme Primärkulturen (Hep-pur) gehalten. (Prä)neoplastische GSTp+ Hepatozyten waren in beiden Ansätzen vorhanden. Es konnte gezeigt werden, dass Anwesenheit von NPCs die DNA Synthese vor allem in den (prä)neoplastischen Hepatozyten fördert. Wurden die NPCs mit pro-inflammatorisch wirksamem Lipopolysaccharid vorbehandelt, konnte die DNA Synthese noch weiter gesteigert werden. Als nächstes wurde der Einfluss nicht parenchymaler Wachstumsfaktoren getestet. Tumor Nekrose Faktor a (TNFa), Interleukin-6 (IL-6) und Fibroblasten Wachstums Faktor 2 (FGF-2) änderten die DNA-Syntheseraten von Hepatozyten kaum.<br />Hepatozyten Wachstumsfaktor (HGF), Keratinozyten Wachstumsfaktor (KGF = FGF-7), FGF-8, FGF-9, FGF-18, FGF-19 und Heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) bewirkten gesteigerte DNA Synthese, vor allem in GSTp+ Zellen. Diese Faktoren könnten daher für den Wachstumsvorteil verantwortlich sein, den präneoplastische Hepatozyten im allgemeinen aufweisen. Von diesen untersuchten Faktoren war HB-EGF am stärksten wirksam. Er induzierte sogar Mitosen in GSTp+ Zellen. Eine Untersuchung der mRNA Expression in hyperplastischen und regenerierenden Lebern zeigte nur für FGF-1, FGF-2, FGF-18 und HB-EGF erhöhte mRNA Syntheseraten. Innerhalb der Leber wurden die Produktion von HB-EGF, HGF, FGF-2, FGF-7, FGF-9 und FGF-18 vorwiegend in NPCs nachgewiesen. Nur die HB-EGF Sekretion konnte durch Vorbehandlung der NPC-Fraktion mit pro-inflammatorischem Lipopolysaccharid noch weiter gesteigert werden. In Rattentumoren war die Expression von HB-EGF, FGF-1, -2 und -7 im Vergleich zum Umgebungsgewebe leicht und die von FGF-18 tendenziell stärker erhöht.<br />Die vorliegende Arbeit fand mehrere Faktoren, die die DNA Synthese präferentiell in (prä)neoplastischen GSTp+ Zellen erhöht. Der am stärksten wirkende Faktor war HB-EGF. Da dessen Expression durch pro-inflammatorische Stimuli gesteigert werden konnte scheint er ein sehr wichtiger Faktor in der Entzündungs-assoziierten Hepatokarzinogenese zu sein.<br />

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common causes of cancer deaths worldwide. This disease almost always occurs in chronically inflamed livers. Inflammation leads to an activation of non parenchymal cells (NPC) in the liver. The impact of NPCs and NPC-derived growth factors on growth stimulation of preneoplastic hepatocytes and possible promotion of tumor development was the main focus of the present thesis.<br />For our investigations rats were treated with the carcinogen N-nitrosomorpholine, which induced the occurrence of (pre)neoplastic hepatocytes that are detectable by their selective expression of the placental glutathione-S-transferase (GSTp+). Twenty-one days after treatment liver cells were isolated by collagenase perfusion and two types of hepatocyte cultures were prepared: (i) conventional ones containing NPCs (Hep-conv) and (ii) hepatocytes purified from NPCs (Hep-pur). Preneoplastic GSTp+ hepatocytes were present in both cultures. It could be shown that the presence of NPCs as well as NPC-supernatant stimulated DNA synthesis preferentially in cultured (pre)neoplastic hepatocytes. Pretreatment of NPCs with pro-inflammatory lipopolysaccharide (LPS) further increased DNA-synthesis. Next the impact of NPC-derived growth factors was tested. Tumor necrosis factor a (TNFa), interleukin 6 (IL-6), and fibroblast growth factor 2 (FGF-2) hardly altered DNA synthesis rates. Hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor (KGF = FGF-7), FGF-8, FGF-9, FGF-18, FGF-19, and heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) elevated DNA synthesis in unaltered hepatocytes and even more pronounced in (pre)neoplastic GSTp+ cells. They might therefore be candidate factors responsible for the mediation of growth advantage of preneoplastic cells. Among these factors HB-EGF was the strongest, inducing even mitosis of the preneoplastic cell population.<br />Examination of the mRNA expression in hyperplastic and regenerating livers showed elevated levels of FGF-1, FGF-2, FGF-18, and HB-EGF only.<br />Within the liver synthesis of HB-EGF, HGF, FGF-2, FGF-7, FGF-9, and FGF-18 was detected preferentially in NPCs. However, expression levels could be elevated only for HB-EGF when exposing NPCs to pro-inflammatory lipopolysaccharide (LPS). The mRNA expression of HB-EGF, FGF-1, -2, and -7 in rat tumors was only marginally elevated when compared to the surrounding tissue. FGF-18 showed a tendency towards higher production in liver tumors.<br />Taken together the present thesis found several growth factors that stimulate DNA synthesis preferentially in (pre)neoplastic GSTp+ hepatocytes. Among these HB-EGF appears to be one of the most potent ones that is upregulated upon pro-inflammatory stimuli. This factor seems to be of great importance in inflammation-associated hepatocarcinogenesis.