The chitinolytic system of Hypocrea atroviridis : cloning and characterization of five novel chitinases

Abstract

Filamentous fungi belonging to the genus Hypocrea (anamorph:<br />Trichoderma) are ubiquitous in soil, many of them having economic relevance. Some species such as Hypocrea atroviridis are known for their mycoparasitic and antagonistic properties which enables them to attack and destroy other fungi. Mycoparasitic Hypocrea spp. are therefore used in agriculture as a biological alternative or complementary approach to chemical pesticides to control fungal pathogens of economically important crops. The mycoparasitic abilities of Hypocrea species are due to a complex interplay of different mechanisms including the secretion of lytic enzymes which are used to hydrolyze the host cell-walls and the production of a wide range of secondary metabolites. A major emphasis in mycoparasitism research was placed on chitinases because in most filamentous fungi chitin is the main structural component of the cell-wall. The genome database of the first sequenced Hypocrea sp., H. jecorina was used to analyze the complete spectrum of chitinases from H. jecorina and revealed a total of 18 ORFs encoding putative chitinases, all of them belonging to glycoside hydrolase family18. 11 of them are novel, so far not characterized chitinases. Since H. jecorina is a weak mycoparasite, five novel chitinases (chi18-2, chi18-3, chi18-4, chi18-10 and chi18-13) were cloned from the potent mycoparasite H. atroviridis. The aim of this diploma thesis was to characterize the respective genes, proteins and promoters in silico, to study the expression of the novel chitinase-encoding genes in H. atroviridis and to create alignments and phylogenetic trees to study the evolutionary relationships of fungal chitinases.<br />

Filamentöse Pilze der Gattung Hypocrea (Anamorph: Trichoderma) sind in der Natur in allen Klimazonen weit verbeitet und aufgrund ihrer vielseitigen Eigenschaften finden Hypocrea/Trichoderma Spezies auch industrielle Anwendung. Hypocrea atroviridis ist für seine mykoparasitische und antagonistische Wirkungsweise bekannt und wird daher in der Landwirtschaft als biologisches Pflanzenschutzmittel gegen pflanzenpathogene Pilze eingesetzt. Die mykoparasitische Wirkungsweise von Hypocrea-Arten beruht auf einem komplexen Zusammenspiel von verschiedenen Mechanismen, wie z. B. die Bildung von lytischen Enzymen, die für den Abbau der Wirtszellwand verantwortlich sind und der Produktion von einer Bandbreite an sekundären Metaboliten. Chitinasen wird von den Enzymen, die am Abbau der Wirtszellwand beteiligt sind, besondere Bedeutung beigemessen, da Chitin der strukturelle Hauptbestandteil der Zellwand von vielen filamentösen Pilzen ist. Die Genomdatenbank der ersten vollständig sequenzierten Hypocrea-Spezies H. jecorina wurde in dieser Diplomarbeit benutzt, um das komplette Spektrum an Chitinasen in H. jecorina zu anaylsieren und phylogenetisch zu untersuchen. Basierend auf diesen Daten wurden neue orthologe Chitinasen in H. atroviridis kloniert, da H. atroviridis eine weitaus stärkere mykoparasitsche Aktivität als H. jecorina aufweist. H. jecorina besitzt 18 Gene, die für Chitinasen kodieren, welche alle zur Glykosid-Hydrolase Familie 18 gehören. 11 dieser Chitinasen wurden bisher nicht charakterisiert. In H. atroviridis wurden fünf neue Chitiansen kloniert: chi18-2, chi18-3, chi18-4, chi18-10 und chi18-13. Die Gen- und Proteinstrukturen und Promotoren sowie die transkriptionelle Regulation der neuen Chitinasen wurden untersucht. Weiters wurden im Zuge der phylogenetischen Analyse Stammbäume erstellt, die die Verwandtschaftsbeziehungen der Chitinasen von filamentösen Pilzen darstellt.