Development, validation and application of molecular biological methods in drinking water analysis refining classical microbiological approaches

Abstract

Molekularbiologische Techniken finden zunehmend Einsatz in umweltanalytischen Fragestellungen. Besonders in der Analyse der mikrobiologischen Wasserqualität werden sie vermehrt angewendet um detailliertere Informationen von klassischen mikrobiologischen Parametern zu gewinnen. Diese Dissertation stellt drei Entwicklungen und nachfolgende Evaluierungen von molekularbiologischen Techniken in der mikrobiologischen Analyse vor.<br />Bakterielles 16S rDNA-Profiling wurde für die genauere Untersuchung der Koloniebildenden Einheiten (KBE), ein Qualitätsparameter zur Beurteilung der generellen mikrobiologischen Wasserqualität, angewendet. Die Anwendbarkeit dieser Methode wird anhand von drei Beispielen gezeigt.<br />Zusätzlich zum methodischen Hintergrund wird der wissenschaftliche Wert und ein zukünftiger Einsatz in der weiterführenden Analyse der Wasserqualität diskutiert. In einer zweiten Arbeit wird diese Methodik in einer vertiefenden Untersuchung in einem Trinkwasserverteilungsnetz angewandt, um die Methodik der KBE Bestimmung (kultivierbare bakterielle Gemeinschaft) direkt mit der in situ vorhanden bakteriellen Gemeinschaft zu vergleichen. Wiederum gewährte das DNA-Profiling einen genauen Einblick in das System und es konnten zwei getrennte bakterielle Gemeinschaften mit unterschiedlichen räumlichen und zeitlichen Zuordnungen unterschieden werden, was damit in Zusammenhang gebracht werden kann, dass die kultivierbare KBE Fraktion nur einen kleinen Prozentsatz der gesamten bakteriellen Gemeinschaft wiederspiegelt. Eine dritte Entwicklung molekularbiologischer Techniken stellt die Etablierung eines neuen amplified fragment length polymerphism (AFLP) Typisierungsverfahrens speziell für Enterokokken dar. Die Methode wurde an 16 unterschiedlichen Typenstämmen, die sich aus verschiedenen Spezies des Genus Enterokokkus und Streptokokkus zusammensetzen und deren dominantes Vorkommen in Fezes bereits beschrieben wurde, optimiert und getestet. Zusätzlich wurden Stabilität und Trennleistung der entwickelten Methodik bei der Anwendung an 398 Enterokokken Isolaten aus Kuhfezes anhand eines Einzel- und Mischproben Versuchsansatzes bestätigt.<br />In allen drei Anwendungen konnte eine erfolgreiche Kombination von mikrobiologischen und molekularbiologischen Methoden gezeigt werden. Der Einsatz molekularbiologischen Methoden stellt einen Informationsgewinn dar und erlaubt genauere Einblicke in die Resultate klassischer kultivierungsbasierender mikrobiologischer Qualitätsindikatoren. Dies kann, je nach Fragestellung zu einer fundierteren Beurteilung der Ergebnisse in der mikrobiologischen Analyse der Wasserqualität führen.<br />

Molecular biological approaches are increasingly applied in environmental sciences and analytics. Especially in microbiological analysis they present an important tool for additional information and further insights on classical approaches. This thesis presents the development and evalutation of three applications on different microbiological profiling and typing approaches of microbiological water quality indicators. Bacterial 16S rDNA amplicon profiling was evaluated for detailed comparison and differentiation of heterotrophic plate count (HPC) communities, a surrogate parameter to assess the general microbial water quality in drinking and ground water. Beside the methodical background the possible scientific merit as well as potential water management applications are discussed and three examples proved the usefulness of this approach. In a further in depth analysis of this technique the culturable HPC community was compared directly to the in situ bacterial community of a drinking water distribution system. 16S rDNA amplicon profiling provided a detailed insight into the bacterial population dynamics. Two separate communities with distinct spatial and temporal allocations to the investigated distribution system could be determined indicating that HPC represents only a small and incomplete picture on the small fraction of culturable bacteria as compared to the total in situ bacterial community. A third application of molecular biological methods is presented in this thesis, the development of a new amplified fragment length polymorphism (AFLP) typing approach. The method was optimised and applicability was tested on 16 different typestrains of the genus Enterococcus and Streptococcus predominantly occurring in faeces. Additionally the stability and excellent discriminatory power to distinguish different enterococci populations was proven on 398 presumptive enterococci isolates from cattle faeces. All three applications indicate the usefulness of a combined use of classical microbiological techniques with molecular biological methods for further insights and more precise information about accepted traditional microbial water quality indicators. Additionally it allows an often required more precise and substantiated judgment of results recovered by classical cultivation based approaches.