Identification of putative substrates of human polo-like kinase 1 by a combined chemical biology-quantitative mass spectrometry approach

Abstract

Die Protein Kinase Polo-like kinase (Plk1) ist ein Hauptregulator der Mitose und der Zellteilung in Eukaryonten. Wegen der Wichtigkeit von Plk1 fuer die Zellteilung ist es besonders in Tumorzellen, die bekanntlich eine besonders schnelle Zellteilung haben, essentiell. Folglich wird bereits ein Plk1 Inhibitor in klinischen Studien als neues Krebsmedikament getestet. Bis heute sind nur wenige Phosphorylierungsstellen von Plk1 Substraten bekannt und deren Auffindung wurde hauptsaechlich in vitro ausgefuehrt, ohne im Kontext mit zellulaeren regulatorischen System betrachtet zu werden. Ein Experiment im grossen Massstab um Plk1 Substrate in vivo zu suchen wuerde unser Verstaendins der zellulaeren Funktionen von Plk1 sehr verbessern, und koennte weiters die Entwicklung neuer Biomarker fuer Krankheiten, die mit der Dysregulation von Plk1 assoziiert sind, ermoeglichen. Mit Hilfe dieser Biomarker koennte man die Effizienz der Plk1 inhibitorischen Medikamente genauer beobachten. In dieser Dissertation beschreibe ich einen ungerichteten, Proteom-weiten Versuch in humanen Zellen um Plk1 abhaengige Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Dafür verwende ich einen Plk1-spezifischen Inhibitor und quantitative Massenspektrometrie.<br />Das experimentelle Modellsystem fuer diese Arbeit waren HeLa Zellen, die in der Mitose arretiert wurden. Noch vor der Anreicherung von Phosphopeptiden aus diesen Zellextrakten mittels immobilisierter Metallaffinitaetschromatographie (IMAC), und der anschliessenden Analyse mit Hilfe einer Umkehrphasen-HPLC direkt gekoppelt an ein Massenspektrometer, musste die Komplexitaet der Probe durch eine Fraktionierung verringert werden. Deshalb habe ich in einem Vorexperiment versucht eine Methode zu entwickeln, die die groesste Anzahl an Phosphopeptiden liefert. Dafuer habe ich zwei Fraktionierungsmethoden verglichen: Saccharose-Dichte-Zentrifugation (um Chromosomen anzureichern) und eine Chromatographie-basierte Methode mit starkem Kationenaustauscher (SCX). Die Entscheidung fiel nach der Analyse der beiden Methoden auf die SCX Fraktionierung. Fuer die Idenifizierung von Plk1-abhaengigen Phosphorylierungsstellen wurde ein quantitativer Vergleich von Phosphopeptiden, die entweder mit dem Inhibitor behandelt bzw. nicht behandelt wurden, durchgeführt.<br />Dafuer war es noetig, die zwei verschiedenen Proben mit leichtem und schwerem Methanol zu markieren. Dadurch konnten beide Proben gemischt und durch den Massenunterschied der Isotope in der massenspektrometrischen Analyse differenziert werden. Die Verhaeltnisse der integrierten Peptidintensitäten, welche den korrespondierenden markierten Peptiden zugeordnet wurden, wurden verwendet, um deren relative Mengen in den Ausgangsproben zu bestimmen. Der Vergleich dieser beiden Werte erlaubte die Bestimmung der Regulation der Phosphorylierungsstellen nach der Inhibitor Behandlung.<br />Mit Hilfe dieser Methode konnten wir ueber 1100 einzelne Plk1 Inhibitor sensitive Phosphopeptide auffinden. Nach einer Validierung von 47 dieser mittels "Multiple reaction monitoring" (MRM), einer sehr zielgerichteten und sensitiven Technik um relative Quantifizierung zu bestaetigen, konnten 25 davon als Plk1 senstitive Phosphorylierungsstellen wiedergefunden werden. Weiters wurden Phosphospezifsche Antikoerper gegen drei Inhibitor-sensitive Phosphopeptide generiert, die die Ergebnisse bestaetigten. Eine gute Positivkontrolle fuer diesen Grossversuch stellten die 12 bekannten Plk1 Substrate dar (eine Drittel aller bekannten Plk1 Substrate), die ich als Inhibitorsensitiv dedektiert habe.<br />Ich habe mit dieser Studie gezeigt, dass quantitative Phosphoproteomik eine wertvolle Methode ist, die in umfassenden Studien mit Kinase-inhibierenden Medikamenten verwendet werden kann. Die Ergebnisse der Dissertation koennten eine Basis fuer viele zukuenftige biologische und biochemische Experimente sein um die Funktionen von Plk1 in der Zelle besser zu verstehen.<br />

The protein kinase Plk1 is a key regulator of mitotic progression and cell division in eukaryotes. Normal cell division is therefore extremely sensitive to Plk1 levels and activity. Because proliferating cells such as tumor cells are dependent on cell division very much as well and Plk1 inhibition stops the cells from dividing, the pharmaceutical industry is pursuing the generation of Plk1 inhibitors as anti-cancer drugs. Until now, only a few target sites for Plk1 are known, and assays to identify Plk1 substrates have largely been carried out in vitro, without the context of cellular regulatory systems. A large-scale discovery of Plk1-regulated in vivo phospho-sites would be expected to enhance our understanding of the cellular functions of Plk1, and may potentially lead to the development of biomarkers of diseases associated with Plk1 dysregulation, or to assess the efficacy of Plk1-inhibitory drugs. In this thesis I describe for the first time an unbiased proteome-wide approach for the discovery of Plk1-regulated phospho-sites in human cells, based on the use of a specific Plk1 inhibitor and quantitative mass spectrometry.<br />The experimental system chosen was mitotically-arrested HeLa cells.<br />Prior to the specific enrichment of phosphopeptides from extracts of these cells using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), and analysis by reversed-phase liquid chromatography coupled on-line to mass spectrometry, the complexity of the sample required that a prior fractionation step be employed. Thus, before the large-scale analysis I undertook a primary study to establish a fractionation method that would give the greatest yield of phosphopeptides, comparing two fractionation methods: sucrose density centrifugation (to enrich for chromosomes), and strong cation exchange chromatography (SCX). By comparing the numbers of identified phosphopeptides by each method, the decision was made to use SCX fractionation.<br />To identify Plk1-regulated phospho-sites, a quantitative comparison of the phosphopeptides between two different samples prepared from untreated or Plk1-inhibitor treated cells was performed. To allow quantitation by mass spectrometry a label was introduced by esterification of the phosphopeptides from the two conditions with isotopically-distinct forms of methanol. Thus, each peptide was detected in the final mass spectrometric analysis in two variants, spaced by the mass difference of the isotopes. After normalization, the ratio of the peak-areas corresponding to these labeled phosphopeptides was used to determine their relative abundances in the original samples, and hence the fold regulation of the phospho-sites following treatment with the Plk1 inhibitor.<br />By applying this approach we found over 1100 unique Plk1 inhibitor sensitive phosphopeptides. When 47 of these were analysed using multiple reaction monitoring (a highly-targeted, sensitive technique for assessing relative quantification), 25 were found to be downregulated in the inhibitor-treated sample. Further antibodies were raised against three Plk1 inhibitor sensitive phospho-sites; the use of these showed that the phospho-sites were indeed downregulated in vivo upon inhibitor treatment. We were also able to recover one third of all previously-reported Plk1 substrates, providing strong positive controls for the screen.<br />I have demonstrated in this study that quantitative phosphoproteomics is a streamlined and generic tool that can be broadly applied to studies of kinase-inhibitory drugs. The data presented here could provide the basis for many future biological and biochemical experiments to understand how Plk1 functions in the cell, as well as providing potential biomarkers for clinical and diagnostic purposes.