Establishing a multimodal tissue preparation and imaging workflow to study tumor heterogeneity in neuroblastoma

Abstract

Neuroblastoma (NB) is the most common solid tumor in the first year of life andarises during embryonic development of the sympathetic nervous system. Most primary tumors (PT) are located in the adrenal medulla. Clinical, genetic and phenotypic heterogeneity of NB hampers patient stratification and challenges therapeutic approaches, resulting in a 5-year overall survival of about 40% for patients diagnosed with metastatic NB. Yet, tumor heterogeneity in NB has not been addressed in the tissue context and at the protein level.The aim of this project was to establish a multimodal tissue preparation- and imaging workflow to integrate multiplexed imaging techniques and thereby increase the confidence in tumor cell identification while studying tumor heterogeneity at a high-dimensional scale. Three imaging methods were combined, i.e., 3-plex immunofluorescence staining (IF), 3-plex interphase fluorescence-in-situ-hybridization (iFISH) and 41-plex imaging mass cytometry (IMC).Sample preparation and imaging methods were established on NB tumor sections. First, all techniques were optimized separately and subsequently in a combined fashion. Once the workflow was defined, a patient cohort of 41 fresh-frozen, highrisk NB PTs was assembled. For each tumor two consecutive cryosections were prepared, which were IF-stained to allow their alignment and to identify regions of interest (RoI) for IMC on one of the two sections. Upon IF, one slice was used for IMC to study distinct tumor and immune cell clusters, while the second one was used for iFISH to detect patient-specific genetic aberrations. The proposed workflow enabled the analysis of the same tissue region with different imaging modalities and thereby, revealed rare tumor subpopulations, such as CD44+PRPH+ cells. Additionally, phenotypic heterogeneity of the disease was pointed out due to strongly varying cell population proportions between each PT-sample.Obtained results demonstrate proof-of-principle for the interrogation of both immune and tumor subphenotypes with the defined workflow and will ultimately lead to a better understanding of cell-cell interactions and therapeutic targets on the tumor tissue level.

Das Neuroblastom (NB) ist der häufigste solide Tumor im ersten Lebensjahr und entsteht während der embryonalen Entwicklung des sympathischen Nervensystems. Die Mehrheit der Primärtumore ist in der Nebenniere lokalisiert. Die klinische, genetische und phänotypische Heterogenität von NBen erschwert die Patientenstratifizierung und stellt therapeutische Ansätze vor Herausforderungen. Diese trägt somit wesentlich zur schlechteren 5-Jahres Überlebenschance von PatientInnen, mit metastasierendem NB von zirka 40% bei. Trotzdem ist derzeit wenig über die Tumorheterogenität im Gewebekontext bzw. auf Proteinebene beim NB bekannt. Ziel dieses Projekts war es einen multimodalen Gewebepräparations- und Bildgebungs-Arbeitsablauf für Tumorgewebe zu etablieren, um verschiedene multimodale Färbetechniken zu kombinieren und dadurch die Präzision der Identifizierung von Tumorzellen zu erhöhen. Des Weiteren sollte der entwickelte Arbeitsablauf es ermöglichen, die Tumorheterogenität auf einer hochdimensionalen Ebene zu untersuchen. Dafür wurde drei Bildgebungsmethoden kombiniert, nämlich 3-plex- Immunfluoreszensfärbung (IF), 3-plex-Interphasen-Fluorszenz-in-situ-Hybdridisierung (iFISH) und 37-plex-Imaging Massenzytometrie (IMC).Das multimodale Gewebepräparations- und Bildgebungsverfahren wurde an NB Tumorschnitten etabliert. Zuerst wurden alle Techniken separat und anschließend in kombinierten Protokollen optimiert. Nachdem der Arbeitsablauf festgelegt war, stellten wir eine Patientenkohorte aus 41 frisch eingefrorenen, Hochrisiko-NB-Primärtumoren (PT) zusammen. Für jede Probe wurden zwei konsekutive Kryoschnitte angefertigt und entsprechend dem IF-Protokoll gefärbt, um interessante Regionen für die IMC zu identifizieren und um die parallelen Schnitte auszurichten. Nach der IF-Färbung verwendeten wir einen Schnitt für IMC, um verschiedener Tumor- und Immunzellcluster zu identifizieren, während der andere Schnitt für iFISH verwendet wurde, um patientenspezifische Aberrationen zu erkennen. Die vorgeschlagene Herangehensweise ermöglichte die Analyse derselben Geweberegion mit verschiedenen Bildgebungsmodalitäten und ermöglichte dadurch die Identifikation von seltenenTumor-Subpopluationen, wie z.B. CD44+PRPH+ Zellen. Darüber hinaus wurde auf Grund der stark variierenden Verhältnisse der einzelnen Zellpopulationen die phänotypische Diversität der Krankheit bestätigt. Die erhaltenen Ergebnisse demonstrieren, dass der definierte Arbeitsablauf geeignet ist, um sowohl Immun- als auch Tumor Subphänotypen zu untersuchen und wird zukünftig zu einem besseren Verständnis von Zell-Zell Interaktionen und zur Aufklärung therapeutischer Zielmoleküle beitragen.