Genetische Manipulationen in Trichoderma reesei und Trichoderma atroviride - Auxotrophe Selektionsmarker und das CRISPR/Cas9 system

Abstract

Trichoderma reesei und Trichoderma atroviride sind filamentöse und in der Industrie etablierte Pilze. T. reesei ist vorallem bekannt durch seine hohe Produktions- und Sekretionsrate an Zellulose verdauenden Enzymen, während T. atroviride meist als biologischer Schädlingsbekämpfer Verwendung findet und Pflanzen vor anderen pathogenen Pilzen schützt. Der Zugang zu einer Vielzahl an unterschiedlichen genetischen Methoden ist eine wichtige Grundlage in der Erforschung von Mikroorganismen und ihrer Anwendung. Für die Forschung und weitere Anwendungen dieser zwei Stämme benötigt es allerding mehr genetischer Werkzeuge, insbesondere bei der Selektion. In dieser Diplomarbeit wurden zwei auxotrophe Marker, Δhis1 und Δpyr4, in T. reesei und T. atroviride auf zwei unterschiedliche Arten entwickelt und evaluiert. Das his1 Gen kodiert für die ATP phosphoribosyltransferase, ein wichtiges Enzym in der Biosynthese von Histidin. Das pyr4 Gen hingegen kodiert für Orotidine 5'-phosphate decarboxylase, welches notwendig ist für die Uridin Synthese. Stämme mit einem Mangel an einem der zwei Gene müssen mit den entsprechenden Biomolekülen supplementiert werden, damit der Organismus überlebensfähig ist. Die Wiederherstellung von auxotrophen Marker-Genen führt zu einer Wiedergewinnung der Prototrophie, nach welcher während einer Transformation selektioniert werden kann.Der T. reesei Δhis1 Stamm wurde durch Ausnutzen des homologen Rekombinations (HR) Reparaturmechanismus gebildet, welcher für eine hohe Gen-Targeting Effizienz sorgt. Aufgrund der Deletion entwickelt dieser Stamm eine Histidin-Auxotrophie und kann als Plattform für weitere Transformationen genutzt werden. Es kann hierbei nach der Wiedererstellung der Prototrophie selektioniert werden, wenn bei der Transformation die his1 Funktion wiederhergestellt wird. Der epigenetische Effekt, den der auxotrophe marker locus auf ein Insert hat wurde evaluiert, indem der Marker his1 mit zwei bereits etablierten Marker Systemen (Δpyr4 und Δasl1) verglichen wurde. Es konnte ein signifikanter Unterschied in der Gen Expression eines eyfp Inserts, dass sich in der Nähe der auxotrophen Marker befand, beobachtet werden. Diese Beobachtung zeigt auch, dass es möglich ist, spezielle auxotrophe Marker zu verwenden mit dem Ziel einen bestimmten epigenetischen Effekt auf die Gen Expression erzielen zu können.Ebenfalls wurden zwei T. atroviride Δpyr4 Stämme mittel des fehleranfälligen nichthomologen End-zu-End-Verknüpfungs (NHEJ) Reparaturmechanismus generiert. Einer diese Stämme beinhaltet auch einen NHEJ-Mangel, durch eine partielle Deletion des tmus53 Gens, welches für eine DNA-Ligase kodiert, die in der NHEJ-Reparatur von wichtiger Bedeutung ist. Solche Stämme sind von besonderer Bedeutung da sie eine höhere Gen-Targeting Effizienz bei HR unterstützen Transformation liefern. Die NHEJ Reparatur während der Transformation wurde durch das gezielte Einführen von Doppelstrangbrüchen (DSB) induziert, welche mithilfe des CRISPR/Cas9 Systems durchgeführt werden konnten.Obwohl mehrere nützliche Stämme erfolgreich generiert und evaluiert werden konnten benötigt es dennoch weiterer genetischer Werkzeuge. Eine weitere Untersuchung der generierten T. atroviride Stämme, ähnlich wie es für T. reesei Δhis1 durchgeführt wurde, ist ebenso anzuraten.

Trichoderma reesei and Trichoderma atroviride are filamentous fungi with established industrial uses. T. reesei is known for its high production and secretion rate of cellulose degrading enzyme, whereas T. atroviride is mainly used as a biocontrol agent protecting plants from other fungal pathogens. Having access to a wide variety of genetic methods is the necessary basis for all research concerning these microorganisms and their applications. The research and further applications of these two fungi however requires additional tools, especially concerning selection. During this diploma thesis two different auxotrophic marker strains, Δhis1 and Δpyr4, were created and evaluated using two different transformation approaches in T. reesei and T. atroviride respectively. The gene his1 encodes for ATP phosphoribosyl transferase, a protein essential in the biosynthesis of histidine. The gene pyr4, on the other hand, encodes for orotidine 5’-phosphate decarboxylase, which is essential in uridine synthesis. Strains that have deficiencies in either of these gene must be supplemented with the respective biomolecule for the organism to survive. Reestablishment of the auxotrophic marker gene leads to the regaining of prototrophy, which is commonly used as a selection tool during transformation.The T. reesei Δhis1 strain was generated using homologous recombination (HR) allowing for efficient gene targeting. This strain developed a histidine auxotrophy due to the deleted gene, allowing it to be used as platform for further transformations. The regaining of prototrophy during this step can be used as selection tool if the genetic manipulation applied also restores his1 functionality. Additionally, the auxotrophic marker generated in T. reesei (Δhis1) was evaluated for its epigenetic influence on integrate gene expression by comparing this marker, to two already established auxotrophic markers systems (Δpyr4 and Δasl1). A significant epigenetic effect was observed between the three markers, resulting in different gene expressions for an eyfp gen that was integrated near the auxotrophic marker loci. This observation also highlights the need for a multitude of auxotrophic markers to be available as it allows researchers to additionally finetune integrate gene expression at an epigenetic level.The T. atroviride Δpyr4 strains were generated using the more error prone non-homologous end joining (NHEJ) repair mechanisms instead of HR. The NHEJ repair could be successfully induced by introducing targeted double strand breaks (DSB) using the CRISPR/Cas9 system. Additionally, to this uridine auxotrophic strain another with an additional NHEJ-deficiency was generated, by deleting a portion of the tmus53 gene, which encodes for a DNA ligase that facilitates NHEJ repair. NHEJ-deficient strains are also an important tool in genetic research as they allow for a more efficient gene targeting when HR mediated transformation is performed.While various strains useful for further studies could be created and partially evaluated there is still a need for more genetic tools. Further evaluations of the T. atroviride strains generated, similarly to how it was done for the T. reesei Δhis1, is also recommended before their application is ultimately established.