Functional multi-omics approaches for secondary metabolite discovery and transmembrane transporter lipid interaction

Abstract

Massenspektrometrie (MS)-basierte Multi-Omics-Analysen repräsentieren einen neuartigen Ansatz, in welchem biologische Systeme nicht mehr ausschließlich auf isolierten molekularen Ebenen untersucht werden, sondern Daten und Informationen aus verschiedenen Omics-Schichten verwoben werden, um ein ganzheitliches Verständnis zellulärer Prozesse zu erlangen.Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Multi-Omics-Strategien zur Identifizierung und Charakterisierung von Pilz-Sekundärmetaboliten angewendet. Konkret wurden dabei die biosynthetischen Gencluster (BGCs) von Ilicicolin und Diaporthin in Trichoderma reesei sowie von Ustiloxin B in Aspergillus flavus untersucht. Durch die genetische Überexpression des Transkriptionsfaktors des Ilicicolin-BGC konnte der Cluster erfolgreich aktiviert und Ilicicolin H, ein Polyketid-nichtribosomales-Peptid-Hybridmolekül, in großen Mengen produziert werden. Mithilfe von molekularem Networking wurde darüber hinaus ein neues, antimykotisches Mitglied der Ilicicolin-Familie identifiziert: Ilicicolin K. Durch Ausdehnung dieser Transkriptionsfaktor-Überexpressionsstrategie auf den ebenfalls normalerweise stummen Diaporthin-BGC gelang auch hier eine erfolgreiche Aktivierung. Es stellte sich heraus, dass das Hauptprodukt dieses Clusters in T. reesei nicht, wie in anderen Pilzen, Diaporthin ist, sondern Diaporthinsäure, ein Polyketid-Synthase-Produkt, für welches wir auch einen vorläufigen Biosyntheseweg vorschlagen konnten. In A. flavus untersuchten wir zudem zwei Modellpeptide, die ribosomal synthetisiert und post-translational modifiziert (RiPPs) werden, Ustiloxin B und Asperipin-2a. Diese beiden Peptide wurden verwendet, um einen maßgeschneiderten Probenvorbereitungs- und Flüssigchromatographie (LC)-MS Workflow zu entwickeln, welcher die Entdeckung von RiPPs aus Pilzen zukünftig erleichtern soll.Im nachfolgenden zweiten Teil wurde die Regulation des humanen Serotonin- (hSERT) und des humanen Noradrenalin-Transporters (hNET) durch interagierende Lipide untersucht. Für hSERT wurde eine spezifische Interaktion zwischen dem Transporter und Cholesterol nachgewiesen. Um die jeweiligen Bindungsstellen zu identifizieren, entwickelten wir ein umfassendes Anreicherungsprotokoll, welches Photo-Crosslinking, Immunopräzipitation, Click-Chemie und Anreicherung auf Streptavidin-Beads umfasste. Die identifizierten Bindungsstellen lagen ausschließlich außerhalb der Transmembran-Domänen, was wir auf das verwendete PhotoClick-Cholesterol zurückführten, welches vermutlich nicht korrekt in die Membran integriert wurde. Im hNET-Kapitel wurde umfangreich ein Probenvorbereitungs- und LC-MS-Workflow etabliert, um Phosphatidylinositol (PI) und dessen phosphorylierten Derivate (PIPs) aus Zellen zu messen. Obwohl die finale Methode in der Lage war, underivatisierte PIs und PIPs zu detektieren, war die Sensitivität nicht ausreichend, um endogenes PIP2zuverlässig direkt aus Zellextrakten zu quantifizieren. Daher wechselten wir zu einem Derivatisierungsprotokoll, mit welchem schließlich der PIP2-Gehalt in untransfizierten sowie in mit mGFP-hNET transfizierten CHO- und HEK-Zellen erfolgreich bestimmt werden konnte.Zusammenfassend unterstreicht diese Arbeit das Potential und die Vielseitigkeit von MS-basierten Multi-Omics-Analysen, sowohl im Bereich der Naturstoffentdeckung als auch zur Aufklärung von Transporter-Lipid-Interaktionen.

Mass spectrometry (MS)-based multi-omics analyses represent a novel approach, in which biological systems are no longer studied at isolated molecular levels, but data of different omics layers is integrated to gain a holistic understanding of cellular processes.In the first part of this thesis, we applied multi-omics strategies for identification and characterization of fungal secondary metabolites. Specifically, we investigated the ilicicolin and diaporthin biosynthetic gene clusters (BGCs) in Trichoderma reesei, and the ustiloxin BGC in Aspergillus flavus. Through genetic overexpression of the ilicicolin BGC ́s transcription factor, the cluster could be successfully activated and high-yield production of ilicicolin H, a polyketide-nonribosomal peptide hybrid compound, was achieved. Using molecular networking, we could identify a novel, antifungal member of the ilicicolin family, ilicicolin K. By extending this transcription factor overexpression strategy to the – usually also silent – diaporthin BGC, we achieved activation of this cluster as well. We could assert that the main product of this cluster in T. reesei is not diaporthin, as reported in other fungi, but rather diaporthinic acid, a polyketide synthase product, for which we also inferred a preliminary biosynthesis pathway. In Aspergillus flavus, we examined two model ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs): ustiloxin B and asperipin-2a. These two compounds were used to develop a tailored sample preparation and liquid chromatography (LC)-MS workflow, to facilitate discovery of fungal RiPPs in future endeavors.In the second part of the thesis, we investigated the regulation of human serotonin (hSERT) and norepinephrine transporters (hNET) by interacting lipids. For hSERT, we demonstrated a specific interaction between the transporter and cholesterol. To identify the corresponding binding sites, we developed a comprehensive enrichment protocol, comprising photo-crosslinking, immuno-precipitation, click-chemistry and enrichment on streptavidin beads. The determined binding sites were exclusively located outside the transmembrane domains, which we attributed to the inability of the utilized PhotoClick cholesterol to be properly incorporated into membranes. For hNET, we elaborately established sample preparation and LC-MS methods to detect phosphatidylinositol (PI) and its phosphorylated derivatives (PIPs) directly from cells. Although the final method was capable of detecting underivatized PIs and PIPs, its sensitivity was too low to reliably quantify endogenous PIP2 directly from cell extracts. We therefore switched to a derivatization protocol, with which we finally successfully quantified PIP2 levels in untransfected and mGFP-hNET transfected CHO and HEK cells.Overall, this work highlights the potential and versatility of MS-based multi-omics analyses, both in the field of natural product discovery and to elucidate transporter-lipid interactions.