Super resolution microscopy of nuclear pore complexes combining dSTORM with lattice light sheet microscopy

Abstract

Die Super-Auflösungsmikroskopie hat die biologische Bildgebung revolutioniert, indem sie die Beugungsgrenze des Lichts überwunden hat und die Visualisierung von Zellstrukturen im Nanometerbereich ermöglicht. Unter den verfügbaren Methoden zeichnet sich die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) durch ihre Robustheit, die Verwendung herkömmlicher Fluorophore und validierter Bildgebungspuffer, sowie breite Kompatibilität mit vielen Mikroskopmodalitäten aus. Die Gitter-Lichtblattmikroskopie (LLSM) mit ihrem dünnen, strukturierten Lichtblatt, und entkoppelten Anregungs- und Detektionswegen, bietet eine hervorragende optische Schnittbildung mit minimaler Phototoxizität, geringem Hintergrund und hoher volumetrischer Bildgebungsgeschwindigkeit. Die Kombination dieser beiden Techniken nutzt die Stärken beider Verfahren – die überlegene optische Leistung der LLSM und die zuverlässige Einzelmolekül-Lokalisation der dSTORM. Diese Arbeit präsentiert die Entwicklung und Validierung eines 3D-LLS-dSTORM Arbeitsablaufs auf einem kommerziellen ZEISS Lattice Lightsheet 7 Mikroskop, einschließlich der Entwicklung einer astigmatischen Punktbildfunktion (PSF) für die 3D-Lokalisierung und der Einrichtung einer vollständigen Erfassungs- und Analyseroutine. Die PSF wurde für zwei Laserlinien (561 nm, 640 nm) optimiert, indem zwei integrierte Freiform-Optikelemente mithilfe von Kalibrierungsdateien präzise positioniert wurden. Eine quantitative Bewertung, die über die Berechnung der erforderlichen Z-Kalibrierungen hinausging, und eine Zernike Polynom Analyse sowie eine Cramér-Rao-Untergrenze Schätzung umfasste, bestätigte, dass die resultierenden PSFs einen kontrollierten Astigmatismus aufwiesen, Aberrationen minimierten und theoretische Lokalisierungsgenauigkeiten von 10–30 nm lateral und unter 100 nm axial erreichten.Der Arbeitsablauf wurde auf fixierte U2OS-Zellen angewendet, die Nup96-SNAP exprimieren und mit Alexa Fluor 647 markiert wurden, einer etablierten Referenz für die Super-Auflösungsbildgebung. Die rekonstruierten Bilder zeigten ringförmige Kernporenkomplexe (NPC), die mit ihrer bekannten Morphologie überein-stimmen, was die Durchführbarkeit der Methode bestätigte. Zu den verbleibenden Herausforderungen gehören unvollständige NPC-Rekonstruktionen aufgrund begrenzter Markierungseffizienz, verbleibende Aberrationen und die Verwaltung großer Lokalisierungsdatensätze. Insgesamt schafft diese Arbeit einen robusten und anpassungsfähigen Rahmen für die Durchführung von dSTORM auf einer LLSM-Plattform, der die methodische Zugänglichkeit von ersterem mit den optischen Vorteilen von zweiterem kombiniert. Der präsentierte Arbeitsablauf legt den Grundstein für zukünftige nanoskalige Untersuchungen komplexer zellulärer Strukturen.

Super-resolution microscopy has revolutionized biological imaging by overcoming the diffraction limit of light, allowing visualization of cellular structures at the nanometer scale. Among the available approaches, direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) stands out for its robustness, use of conventional fluorophores and validated imaging buffers, and broad compatibility with many microscope modalities. Lattice light-sheet microscopy (LLSM), with its thin, structured light-sheet and decoupled excitation and detection pathways, provides excellent optical sectioning with minimal phototoxicity, low background, and high volumetric imaging speed. Combining these two techniques leverages the strengths of both – LLSM’s superior optical performance and dSTORM’s reliable single-molecule localization capabilities. This thesis presents the development and validation of a 3D-LLS-dSTORM workflow on a commercial ZEISS Lattice Light-Sheet 7 microscope, including the engineering of an astigmatic point spread function (PSF) for 3D localization and the establishment of a complete acquisition and analysis pipeline. The PSF was optimized for two laser lines (561 nm, 640 nm) by precisely positioning two integrated free-form optical elements via calibration files. Quantitative evaluation that went beyond calculating the required z-calibrations, including Zernike polynomial analysis and Cramér–Rao lower bound estimation, confirmed that the resulting PSFs exhibited well-controlled astigmatism, minimized aberrations, and achieved theoretical localization precisions of 10–30 nm laterally and below 100 nm axially. The workflow was applied to fixed U2OS cells expressing Nup96-SNAP labeled with Alexa Fluor 647, a well-established refer-ence for super-resolution imaging. The reconstructed images successfully revealed ring-like nuclear pore complex (NPC) structures consistent with their known morphology, confirming the method’s feasibility. Remaining challenges include incomplete NPC reconstructions due to limited labeling efficiency, residual aberrations, and data management of large localization datasets. Overall, this work establishes a robust and adaptable framework for performing dSTORM on a lattice light-sheet platform, combining the methodological accessibility of dSTORM with the optical advantages of LLSM. The developed 3D-LLS-dSTORM workflow lays the foundation for future nanoscale studies of complex cellular structures.