Identification and activation of biosynthetic gene clusters in Trichoderma aggressivum for secondary metabolite discovery

Abstract

Pilzliche Sekundärmetabolite stellen eine umfangreiche Quelle bioaktiver Moleküle mit ökologischer, pharmazeutischer und industrieller Relevanz dar. Ihr biosynthetisches Potenzial bleibt jedoch häufig ungenutzt, da viele Gencluster unter Standard-Laborbedingungen transkriptionell stillgelegt sind. Trichoderma aggressivum, ursprünglich als Erreger der Champignonkrankheit bekannt, ist besonders spannend, da verwandte Trichoderma-Arten bereits als Produzenten bioaktiver Metabolite beschrieben wurden. Sein bislang weitgehend unerforschtes Genom macht T. aggressivum zu einem vielversprechenden Kandidaten für die Entdeckung neuartiger Verbindungen. Eine auf antiSMASH basierende Genomanalyse identifizierte 79 Biosynthese-Gencluster, verteilt über 31 Scaffolds, von denen fünf für die experimentelle Aktivierung priorisiert wurden. Clusterassoziierte Transkriptionsfaktoren (TF) wurden einzeln in einem pyr4-Deletionsstamm eingebracht, was zur Etablierung von 15 stabilen homokaryotischen Transformanten führte. RT-qPCR-Analysen zeigten eine deutliche Hochregulation der Ziel-TFs in mindestens 12 der 15 Fälle. Zwei Clusterregionen (5.4 und 9.3) konnten durch entsprechende TF-Überexpression transkriptionell aktiviert werden. Zwei weitere TFs induzierten Transkriptionsveränderungen in Genen außerhalb ihrer vorhergesagten Cluster, was auf mögliche kreuzregulatorische oder globale Effekte hindeutet. Antibakterielle und antifungale Konfrontationstests ergaben keineneuartigen Effekte. Darüber hinaus waren die aus Clusterregion 5.4 zu erwartenden Metaboliten auf der Grundlage eines zuvor charakterisierten homologen BGC in T. guizhenese mittels LC-MS-Analyse noch nicht nachweisbar. Dennoch deuteten Pigment- und Morphologieänderungen auf eine Modulation des Sekundärstoffwechsels hin. Die Ergebnisse zeigen, dass die gezielte TF-Überexpression in T. aggressivum eine Aktivierung stiller Biosynthesecluster ermöglicht und die Art ein vielversprechendes System für die Entdeckung neuer Sekundärmetabolite darstellt.

Fungal secondary metabolites represent a rich source of bioactive molecules withecological, pharmaceutical, and industrial relevance. However, their biosynthetic potential often remains untapped, as many gene clusters remain transcriptionally silent under standard laboratory conditions. Trichoderma aggressivum, mainly known as a pathogen responsible for causing mushroom disease, is particularly interesting be cause related Trichoderma species have already been described as producers of bioactive metabolites. Its largely unexplored genome makes T.aggressivum a promising candidate for the discovery of novel compounds.A genome-wide analysis using antiSMASH identified 79 biosynthetic gene clusters(BGCs) distributed across 31 scaffolds, of which five were prioritized for experimental activation. Cluster-associated transcription factors (TFs) were individually integrated in a pyr4 deletion strain, resulting in the establishment of 15 stable homokaryotic transformants. RT-qPCR analyses revealed substantial upregulation of the target TFs in at least 12 of the 15 cases. Two cluster regions (5.4 and 9.3) could be transcriptionally activated through the corresponding TF overexpression. Two other TFs induced transcriptional changes in genes outside their predicted clusters, suggesting possible cross-regulatory or global effects. Antibacterial and antifungal confrontation assays did not reveal any novel effects. Furthermore, based on a previously characterized homologous BGC in T.guizhenese, the metabolites expected from cluster region 5.4 were not yet detectable by LC-MS analysis. Nevertheless, changes in pigmentation and morphology indicated modulation of secondary metabolism.These results demonstrate that targeted TF overexpression in T. aggressivum enables activation of silent BGCs and highlight the species as a promising system for the discovery of new secondary metabolites.