Microfluidic protein analysis of human breast Milk - from colorimetric assays to Lab-on-a-Chip analysis

Abstract

Muttermilch gilt allgemein anerkannt als die beste Form der Ernährung für Säuglinge und Frühgeborene. Die zu Assayerten bis tausendenden enthaltenen verschiedenen Bestandteile, spielen nicht nur in der Ernährung der Säuglinge eine entscheidende Rolle sondern erfüllen darüber hinaus unzählige verschiedenen Eigenschaften die zum Wachstum und der Entwicklung des kindlichen Immunsystems beitragen. Die einzelnen Muttermilchbestandteile dienen unter anderem dem Schutz vor Infektionen und Entzündungen, des Weiteren regen sie die Reifung des Immunsystems sowie Organentwicklung an und tragen zu einer gesunden mikrobiellen Kolonisierung bei. Da die Zusammensetzung von Muttermilch über die Zeit nicht konstant ist und darüber hinaus durch vielfältige Faktoren beeinflusst wird, ist eine ausreichende Nährstoffzufuhr des Kindes im Zuge des Stillens nicht notwendigerweise garantiert. Insbesondere die speziellen Bedürfnisse von Frühgeborenen, welche zum einen besonders verletzlich sind, gepaart mit der Tatsache dass die Muttermilch bedingt durch den zu frühen Zeitpunkt der Geburt noch nicht vollständig entwickelt ist, müssen durch eine Anreicherung der Muttermilch mit Nahrungsergänzungsmitteln für Säuglinge gewährleistet werden. Vielfältige Studien zeigen Nachteile der Ernährung von Kindern durch Säuglingsnahrungen auf, angefangen bei einem erhöhten Risiko der Erkrankung an Nekrotisierende Enterokolitis, bis hin zu diversen neurologischen und immunologischen Störungen. Um diesen Herausforderungen sowie dem sorgfältigen Umgang mit Säuglingsnahrung gerecht zu werden ist ein schnelles, möglichst genaues System zur Routineanaylse von Nährstoffen in Muttermilch erforderlich. Die Neonatologie des AKH Wien benötigt ein solches System, zur einfachen, schnellen und genauen Quantifizierung von Nährstoffen in Muttermilch um sicherzustellen, dass eine gezielte personalisierte Anreicherung erfolgen kann. Zu diesem Zweck möchte das Institut für Elektrotechnik und IT einen mikrofluidischen Chip entwickeln, basierend auf einem mikrofluidischen Design welches an demselben Institut konzipiert wurde. Im Zuge dieser Arbeit wurden drei verschiedene Methoden für die Analyse von Proteinen in Muttermilch nicht nur untereinander sondern auch gegen einen kommerzieller Muttermilchanalysator MIRIS verglichen. UV/Vis-Spektroskopie basierende Methoden (Bromphenolblau/Bradford Assay) sowie eine Kapillargelelektrophorese basierende Methode - der Agilent Bioanalyzer P230 Assay wurden als Alternativen getestet. Diese Arbeit befasst sich darüber hinaus mit den Unterschieden der einzelnen Methoden sowie möglichen Querempfindlichkeiten der Methoden mit anderen Muttermilchbestandteilen, welche die Proteinquantifizierung stören. Ein weiterer Gegenstand dieser Arbeit befasst sich mit dem Transfer des Bradford Assays auf den mikrofluidischen Chip.

Human breast milk and its feeding are generally recognized to be the best form of nutrition for infants and neonates, as it is exhibiting many hundreds to thousands of constituents that do not only play a nutritional role but are also contributing to a lot of different immunologic and growth promoting properties. Human breast milk constituents are protecting against infection and inflammation and are furthermore contributing to immune maturation, organ development, and healthy microbial colonialization. As the composition of human breast milk is not constant over time but highly affected by various factors, a sufficient nutrient intake of the baby is not necessarily guaranteed by breastfeeding. Especially the extraordinary requirements of preterm infants, which are particularly vulnerable combined with the fact that the mother-s milk is not fully developed because of the preterm birth, have to be nourished by an enrichment of human breast milk with infant formulas. As there are several studies reporting disadvantages in feeding infant formulas, starting with a substandard risk to be contracted by necrotizing enterocolitis, up to diverse unequal neurological and immunological outcomes in comparison with infants that were exclusively fed human breast milk. For fast routine analysis for the estimation of macronutrients in human breast milk is required directly at the point-of-care, to ensure a careful handling of infant formula. The Neonatology of the AKH Vienna is in need for an easy, fast and accurate possibility for the quantification of macronutrients in human breast milk for personalized fortification to meet in particular the special needs of preterm infants. To handle these requirements the Institute of Electrical Engineering and IT wants to develop a microfluidic device based on a microchip design developed at the same institute. During this work three different methods for the analysis of proteins in human breast milk were compared not only against each other but also to a commercial human milk analyzer called MIRIS. UV/Vis spectroscopy based on the Bromophenol Blue and the Bradford Assay as well as a capillary gel electrophoresis based method - the Agilent Bioanalyzer P230 Assay - were tested as alternatives. This work is revealing differences between the individual methods as well as potential cross-sensitivities with other human breast milk constituents, eventually disturbing protein quantification. A further subject of this work is the transfer of the Bradford Assay onto the microfluidic device.