Characterization of a mutation in the transactivator Xyr1 of the Trichoderma reesei wild-type strain

Abstract

Der fadenförmige und saprophytische Pilz Trichoderma reesei ist ein in Forschung und Industrie weitflächig genutzter Mikroorganismus. Die Cellulose und Hemicellulose abbauenden Enzyme von T. reesei werden in der Zellstoff, Papier-, Nahrungsmittel-, Futtermittel- und Textilindustrie eingesetzt und sind von großer Bedeutung für die Herstellung von Biokraftstoffen der zweiten Generation. Viele T. reesei Stämme, die in der Industrie verwendet werden, sind Abkömmlinge des Stammes RUT-C30, bei dem keine Kohlenstoff-Katabolitrepression mehr stattfindet. Trotzdem sind nach wie vor induzierende Substanzen für eine zufriedenstellend starke Enzymproduktion nötig. In einem dieser Stämme führt eine einzelne Punktmutation in der "fungal transcription factor middle homology region" (FTFMHR) des Xylanase-Regulators 1 (Xyr1) zu einer erhöhten Expression der Enzyme XynI und XynII in Gegenwart von Glucose, einer normalerweise reprimierenden Kohlenstoffquelle. Untersuchungen zeigen, dass unter normalen Umständen Xyr1 von der vorliegenden Kohlenstoffquelle ein Signal erhält, das zu einer Konformationsänderung und damit zu einer Aktivierung oder Inaktivierung des Proteins führt. Zirkulardichroismus Analysen des mutierten Proteins Xyr1A824V legen nahe, dass eine veränderte Sekundärstruktur durch die Mutation der Grund für eine fehlende Konformationsänderung und damit einer fehlenden Antwort auf die Gegenwart der Kohlenstoffquelle sein könnte. Das Ziel dieser Arbeit ist es einersteits den mutierten Pilzstamm zu charakterisieren und anderereseits durch etwaige Veränderungen der Sekundärstruktur verschiedener Xyr1 und Xyr1A824V Proteinfragmente die Region der Mutation zu untersuchen. Die Experimente zeigen eine Deregulierung und eine stark erhöhte Expression der Xylanase-kodierenden Gene in dem mutierten Stamm, die nicht auf einen veränderten Chromatin-Status zurückzuführen sind. Die neun für diese Arbeit entwickelten und hergestellten Xyr1 und Xyr1A824V Proteinfragmente zeigen keinerlei Reaktion auf Kohlenhydrate und nur eines der Fragmente zeigt eine Änderung der Sekundärstruktur. Dies lässt vermuten, dass zusätzlich zu der Mutation in der FTFMHR, die mutmaßliche Aktivierungsdomäne von Xyr1 für die zuvor beobachteten Veränderungen in der Sekundärstruktur verantwortlich ist. Die Analyse der Tertiärstruktur eines Proteinfragmentes stützt diese Hypothese.

The filamentous and saprophytic fungus Trichoderma reesei is a widely used microorganism in both research and industry. Its cellulose and hemicellulose degrading enzymes are applied in the pulp, paper, food, feed, textile industry and perhaps most importantly, in the production of second generation biofuels. Many T. reesei strains used in industry are descendants from the strain RUT-C30, in which the carbon catabolite repression is eliminated. Despite this, inducing substances are still needed to ensure a satisfactory protein formation. In one of these strains, a single point mutation in the fungal transcription factor middle homology region (FTFMHR) of the xylanase regulator 1 (Xyr1), leads to an expression of enzymes XynI and XynII in the presence of glucose, a normally repressing carbon source. Investigations show that under normal circumstances the carbon source triggers a conformational change of Xyr1 resulting in its activation or inactivation. Circular dichroism (CD) analyses of the mutated protein Xyr1A824V suggest that an altered secondary structure could hinder conformational change and thus cause the missing response of the protein in the presence of a carbon source. The aim of this work is to characterize the mutated strain and to identify and characterize the region around the mutation by looking for changes in the secondary structure of di-erent Xyr1 and Xyr1A824V protein fragments. As a main result a deregulation and strongly enhanced expression of the xylanase-encoding genes in the mutated strain, not resulting from a change in chromatin status, was revealed experimentally. Of nine Xyr1 and Xyr1A824V protein fragments, which were produced in this work, non showed a response to carbohydrates and only one showed a change in secondary structure. The latter also suggests that additionally to the mutation in the FTFMHR, the putative activation domain of Xyr1 is responsible for the previously observed changes in secondary structure. Analyses of the tertiary structure support this hypothesis.