Development of radiolabeled bioorthogonal in vivo click agents for diagnostic pretargeting

Abstract

Bioorthogonale Reaktionen ermöglichen die nukleare Bildgebung (SPECT & PET) von langsam akkumulierenden molekularen Sonden mit kurzlebigen Radionukliden. Diese hochselektiven und biokompatiblen 'Click'-Reaktionen erlauben die Knüpfung von kovalenten Bindungen im lebenden Organismus. Bei der bioorthogonalen Bildgebung wird im ersten Schritt ein mit einem bioorthogonalen Baustein modifizierter Marker (z.B. Antikörper) verabreicht, welcher sich im Zielgewebe anreichert. Nach erfolgter Akkumulation wird ein radioaktiv markiertes, niedermolekulares bioorthogonales 'Pull-Down'-Reagenz (PDR) verabreicht, welches sich mit rascher Pharmakokinetik homogen im Organismus verteilt und an den Marker im Zielgewebe bindet. Durch diesen zweistufigen Prozess können im Vergleich zum direkt markierten Antikörper bessere Kontraste und geringere Strahlendosen erzielt werden. Häufig angewandt wird die kupferfreie Click-Chemie zwischen Cyclooctinen und Aziden, wobei durch die im Cyclooctin vorhandene Ringspannung auf das katalytische (aber zelltoxische) Kupfer(I) verzichtet werden kann. Besonders aber im Bereich der Nuklearmedizin, wo nur äußerst geringe Substanzkonzentrationen vorliegen, hat sich die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (IEDDA) zwischen 1,2,4,5-Tetrazinen und gespannten Alkenen (trans-Cycloocten, TCO) durch besonders hohe Geschwindigkeitskonstanten bewährt. Radiomarkierte 1,2,4,5-Tetrazine sind daher universelle Werkzeuge, welche die Bildgebung von unterschiedlichen TCO-modifizierten (Makro)molekülen mit hohem Kontrast ermöglichen. Zu Beginn der vorliegenden Dissertation (2013) waren nur wenige radiomarkierte Tetrazine bekannt. Diese Substanzen basierten zum überwiegenden Teil auf langlebigen Radiometallen, wobei durch den notwendigen Komplexbildner sehr polare und sperrige Moleküle entstanden. Der Einsatz von kovalent gebundenen, kurzlebigen Nukliden mit hoher Prinzip der bioorthogonalen Bildgebung spezifischer Aktivität (z.B.: Fluor-18) war jedoch durch Stabilitätsprobleme der 1,2,4,5- Tetrazine nicht möglich. In dieser Arbeit wird die Entwicklung von 11C und 18F markierten bioorthogonalen Sonden (Azide und 1,2,4,5-Tetrazine) für die zweistufige Positronen-Emissions-Tomographie beschrieben. Die Auswahl der Zielstrukturen erfolgte durch computergestützte Abschätzung der Reaktivität. Precursorsubstanzen für die nukleophile 18F-Fluorierung oder 11C-Methylierung wurden entwickelt, synthetisiert und charakterisiert. Nicht-radioaktive Referenzsubstanzen wurden zur Identifizierung der radiomarkierten Spezies, sowie zur Bestimmung der spezifischen Aktivität dargestellt. Zusätzlich wurden die Reaktionskinetiken der Tetrazin- Derivate mit dem Dienophil TCO mittels 'Stopped Flow' Messungen photometrisch bestimmt. Die Radiomarkierungs-Reaktionen wurden hinsichtlich Ausbeute und Reaktionsführung optimiert, und auf automatisierte Syntheseeinheiten übertragen, um die bioorthogonalen Sonden (PDRs) in hohen Aktivitäten zu erhalten. Die Fluor-18 markierten PDRs wurden hinsichtlich Identität, radiochemischer Reinheit, Reaktivität gegenüber TCO, sowie Stabilität in Blutplasma untersucht. Eine Auswahl der hergestellten radiomarkierten bioorthogonalen Sonden wurde im murinen Tiermodell untersucht. Hierbei wurde mittels Kleintier-PET/MR die Biodistribution und Pharmakokinetik, so wie durch Analyse von Blut-, Organ- und Harnproben der Metabolismus der jeweiligen Substanzen untersucht. PDRs mit günstigen Eigenschaften wie einer homogenen Biodistribution und hoher metabolischer Stabilität wurden in einfachen Modellen hinsichtlich ihrer in vivo Reaktivität untersucht, wobei z.B.: TCO-modifizierte Siliziumoxid-Nanopartikel in der Lunge mittels bioorthogonaler Kohlenstoff-11 PET sichtbar gemacht werden konnten.

Slow tracer accumulation of imaging probes can be circumvented by pretargeting using bioorthogonal ligations. These fast, highly selective and biocompatible 'click' reactions are capable of forming a covalent linkage between a preadministered marker compound and a labeled Pull Down Reagent (PDR) in vivo. Several applications for the strain promoted azide alkyne cycloaddition (SPAAC) were reported, wherein the ring strain of the cyclooctyne eliminates the need for cytotoxic copper(I) catalysis, rendering this transformation bioorthogonal. Due to particular high ligation rates the bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder reaction (IEDDA) of strained dienophiles with 1,2,4,5-tetrazines (Tz) is especially suitable for applications in nuclear medicine, wherein low reagent concentrations require fast ligation rates. Until recently, only few radiolabeled tetrazines mainly based on radiometals and bulky chelating agents have been reported. However, the beneficial use of short-lived PET isotopes (18F, 11C) employing favorable decay characteristics and high specific activity was limited due to stability and reactivity restrictions. Within this work the development of bioorthogonal probes (organic azides and 1,2,4,5-tetrazines) labeled with short-lived positron emitters carbon-11 and fluorine-18 is described. Precursor substances for nucleophilic 18F-fluorination or 11C-methylation were designed, synthesized and characterized applying standard methods. Non-radioactive reference compounds were also prepared for identification of the radiolabeled species and for determination of specific activity. Radiolabeling procedures were optimized and synthesis sequences programmed to prepare labeled compounds in high activities using automated synthesis modules. Produced PDRs were investigated towards identity, purity, reactivity with trans-cyclooctene (TCO) or cyclooctyne derivatives and stability in human blood plasma. In addition to synthesis and radiolabeling, selected compounds were further evaluated in a murine in vivo model, wherein biodistribution, pharmacokinetics (using PET/MR scanning) and metabolism (as investigated by plasma and urine analysis using radio-TLC or radio-TLC) of the test substances was evaluated. PDRs that showed beneficial properties (homogenous biodistribution, fast renal excretion, high metabolic stability) were further tested towards their applicability for in vivo click chemistry using model substrates like TCO-tagged nanoparticles.