Synthesis of Acinetobacter lipopolysaccharide ligands

Abstract

Die äußere Zellwand Gram-negativer Bakterien wird von einer dichten Schicht an Lipopolysacchariden (LPS) ummantelt, welche drei Abschnitte umfassen: das Lipid A, die innere und äußere Kernregion, und das O-Antigen. Im Zuge einer Infektion sind alle diese Kompartimente in der Stimulation des angeborenen und erworbenen Immunsystems des jeweiligen Wirts involviert. Dabei wird LPS häufig von C-Typ Lektinen erkannt. Diese Ca(2+)-abhängigen, Kohlenhydrat-bindenden Proteine verfügen über eine breite Spezifität für einfache Strukturmotive, die sich ubiquitär auf der Oberfläche von Pathogenen befinden. Beispielsweise erkennt das Mannose-bindende Lektin (MBL) vicinale, diäquatoriale Hydroxylgruppen, wie sie in D-Mannopyranose vorkommen. Während die Interaktion von MBL mit einer einzelnen solchen Struktur schwach und unspezifisch ist, wird eine multivalente Bindung dieser Motive, die in geeigneter Anordnung an der Bakterienoberfläche präsentiert werden, für eine hohe Bindungsaffinität benötigt. Im Gegensatz dazu wurde eine ungewöhnlich starke Bindung der isolierten inneren Kernregion von Acinetobacter haemolyticus zu murinem und humanem Mannose-bindenden Lektinen MBL-A beobachtet. In Zuge der Dissertation sollte das Kohlenhydrat-Epitop, das für diese untypisch spezifische Interaktion mit dem Lektin verantwortlich ist, identifiziert werden, um Einsicht in den Bindungsmechanismus auf molekularer Ebene zu erhalten. Chemische Synthese von ausgewählten Di- bis Pentasaccharidfragmenten lieferte strukturell definierte Liganden für spätere Bindungsstudien (ELISA). Dazu wurden optimierte Glykosyldonoren und -akzeptoren effizient durch stereoselektive O-Glykosylierungen verbunden. Anschließende Modifikationen (Phosphorylierung, Abbau nach Smith) sollen weitere Einblicke darüber geben, welche Teilstrukturen essentiell für die hohe Affinität sind. Eine zentrale Rolle spielte dabei die Entwicklung eines neuen, alpha-selektiven Donors des seltenen Zuckers 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonsäure (Kdo), welcher ein prinzipieller Bestandteil der LPS Kernregion ist. Dieser Donor ermöglichte durch eine temporäre, dirigierende Gruppe hohe Ausbeuten mit absoluter Stereoselektivität. Darauf basierend wurde zusätzlich die erste Syntheseroute zu einem alpha-(2->5)-verknüpften Kdo Disaccharid ausgearbeitet, welches ein charakteristisches Motiv der Kernregion verschiedener Acinetobacter Stämme darstellt. In immunsupprimierten Patienten kann Acinetobacter schwere nosokomiale Infektionen auslösen. Aufgrund seiner Resistenz gegen Desinfektionsmittel und eine Vielzahl an Antibiotika stellt dieser Krankenhauskeim eine zunehmende Bedrohung - besonders in Intensivstationen - dar. Generell sollen durch die Aufklärung des Bindungsmechanismus zwischen MBL-A und der inneren Kernregion von A. haemolyticus die bis jetzt mangelhaft untersuchten strukturellen Voraussetzungen für spezifische Wechselwirkungen zwischen Lektin und Kernregion geklärt werden. Ein fundiertes Wissen über das komplexe Zusammenspiel von LPS und unserem Immunsystem ist für die Entwicklung zukünftiger Behandlungsstrategien unerlässlich.

Lipopolysaccharide (LPS) constitutes the outer leaflet of the gram-negative bacterial cell wall and comprises three compartments: the lipid A, the inner and the outer core, and the O-antigen. During infection all three parts play an important role for the innate and adaptive immune systems of the respective host. In this regard, LPS is frequently recognized by C-type lectins triggering inherent immune response in hosts. These Ca(2+)-dependent sugar binding proteins have a broad specificity for structural motifs that are ubiquitously found on the surface of pathogens. Among them, the mannose-binding lectin (MBL) recognizes structures that display vicinal diequatorial hydroxyl groups like in D-mannopyranose. While the interaction of MBL with an individual binding site is weak, high affinity relies on multivalent binding of appropriately arranged epitopes. In contrast, an untypically strong interaction of the isolated inner core of Acinetobacter haemolyticus to murine and human mannose-binding lectin MBL-A has been observed. Within this thesis, the carbohydrate epitope responsible for this unusual specific interaction with a lectin should be revealed to give insight into the ongoing binding mechanisms in molecular detail. Chemical synthesis of selected di- to pentasaccharide fragments of the inner core provided structurally defined ligands for ensuing binding studies (ELISA). Therefore properly decorated glycosyl donors and acceptors were linked by high yielding and stereoselective chemical O-glycosylation. Subsequent modifications (phosphorylation, Smith degradation) should give further insight into the structural features essential for the high affinity. Stereoselective alpha-glycosylation of the rare sugar 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid (Kdo), which is a principle component of the LPS core, posed the major challenge. Thus, a new potent Kdo donor with excellent glycosylation properties was introduced capitalizing on a temporary directing group which allowed for high yields and complete stereoselectivity. Based on these promising results the first synthetic protocol providing the challenging alpha-(2->5)-interconnected Kdo disaccharide was elaborated. This motif is a characteristic feature of several Acinetobacter strains including the highly pathogenic A. baumannii. In immunocompromised patients Acinetobacter causes severe nosocomial infections and due to long survival on abiotic surfaces and its multi-drug resistance it is becoming an increasing threat especially in intensive care units. In general, revealing the binding mechanism of MBL-A to the A. haemolyticus inner core should contribute to a better understanding of the yet underexplored structural prerequisites of specific lectin-core interactions. A profound knowledge about the complex interplay of LPS and the immune system is necessary for future drug development.