Wheat straw lignin - isolation and characterization of a plant cell wall networking polymer

Abstract

Beim Lignin von einkeimblättrigen Gräsern wie Weizen handelt es sich um ein hochgradig heterogenes Makromolekül, das in der Pflanze in einem ausgeklügelten Zellwandkomplex vorliegt, wo es starke Quervernetzungen mit den Zellwandpolysacchariden ausbildet. Eine geschickte Kombination von verschiedenen Isolierungsmethoden, die an unterschiedlichen Ebenen der Pflanzenzellwandorganisation ansetzen, wie konventioneller Lignin-Isolierungsmethoden und kürzlich entwickelter Protokolle zur Isolierung von Lignin-Kohlehydrat-Komplexen, ermöglicht es anhand der erhaltenen Daten ein erweitertes Bild von Weizenstroh-Lignin und seiner Organisation innerhalb des Zellwandverbundes zu entwerfen. Im Zuge dieser Thesis wurden bei der Isolierung des Weizenstroh-Lignins zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Im ersten Fall wurden etablierte Lignin-Isolierungsmethoden in einer neuartigen Abfolge kombiniert. Nach einer Vorbehandlung des Strohs in einer Vibrationskugelmühle wurde die erste Lignin-Fraktion mit neutralem Dioxan-Wasser extrahiert. In weiterer Folge wurde zur Isolierung der zweiten Lignin-Fraktion das verbleibende Stroh in mild-saurem Dioxan-Wasser extrahiert. Diesem ersten Ansatz folgend wurden 82% des Klason-Lignins (KL) im Ausgangsstroh in vier getrennten Fraktionen isoliert: -Free Lignin-, zugänglich durch Dioxan-Wasser Extraktion bereits ohne Vorbehandlung des Strohs durch Kugelmahlen, zeichnet sich durch eine sehr niedere mittlere Molmasse aus, ist verknüpft mit Glucan, enthält hohe Anteile von p-Hydroxyzimtsäuren und Tricin und repräsentiert 14% des KL des Ausgangsstrohs. "Dioxan Lignin" wurde nach einer Mahldauer von 8h durch neutrale Dioxan-Wasser Extraktion gewonnen und steht für 18% des KL. Es liegt verknüpft mit linearem Arabinoxylan vor und aufgrund seiner monomeren Zusammensetzung wird als sein Ursprung die Mittellamelle angenommen. -Acidolysis Lignin-, die Fraktion mit dem größten Anteil am KL im Ausgangsstroh (38%), wurde in der zweiten, mild-sauren Extraktionsstufe gewonnen. Es zeigt Verknüpfungen mit verzweigtem Arabinoxylan und wurde aufgrund hoher Vorkommen von Syringyl- und p-Hydroxyzimtsäure-Einheiten der Sekundärzellwand zugeordnet. Die vierte Fraktion dieses Isolierungsprotokolls enthält das im restlichen Stroh verbliebene Lignin, das sich als resistent gegenüber aller angewendeter Methoden herausstellte. Der zweite Ansatz hatte eine höhere Ebene der Zellwandorganisation zum Ziel und bestand aus einem Fraktionierungsprotokoll für Holz bzw. Holzpulpe in sogenannte Lignin-Kohlehydrat-Komplexe, das hier zum ersten Mal für Weizenstroh verwendet wurde. 95% des Ausgangsstrohs konnten in zwei Fraktionen wiedergefunden werden, die je nach Polysaccharidanteil als -Glucan-Lignin- und -Xylan-Lignin- bezeichnet wurden. Die Monomerenverhältnisse der Ligninanteile dienten zur Zuordnung der Fraktion zu entweder Mittellamelle ("Xylan-Lignin") oder Sekundärzellwand ("Glucan-Lignin"). In einem dritten Versuch wurde -Dioxan Lignin- präparativ nach seiner Molmasse fraktioniert: Fraktionen hoher Masse zeigen gehäuft p-Hydroxyphenyl- und p-Hydroxyzimtsäure-Einheiten und sind mit linearem Arabinoxylan verknüpft, während Fraktionen niederer Masse höhere Anteile von Syringyl- und Guajacyl-Einheiten aufweisen. In einer der Fraktionen wurde ein verstärktes Auftreten von Dibenzodioxocin-Bindungen und Ferulasäure beobachtet, während der Gehalt an freien Carboxylgruppen sehr niedrig ist. Gleichzeitig besteht der Polysaccharidanteil dieser Fraktion beinahe ausschließlich aus Arabinoxylan, was darauf hindeutet, dass sich in dieser Fraktion vermehrt strukturelle Motive finden lassen, die über obengenannte Komponenten das Lignin mit den Zellwandpolysacchariden vernetzen. Tricin wurde ausschließlich in den Fraktionen niederer Masse gefunden, wo außerdem auch Glucan-Anteile festgestellt wurden. Diese beiden Charakteristika der Fraktionen niederer Masse unterstützen die These, dass "Free Lignin" innerhalb der "Dioxan-Liginin" Fraktion vorliegt, wie es in Chapter 1 vorgeschlagen wird. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Lignin-Fraktionen aus Weizenstroh isoliert und detailliert charakterisiert. Dabei zeigten sich signifikant unterschiedliche Strukturen und Zusammensetzungen bezüglich des Lignins selbst als auch bezüglich der jeweiligen Polysaccharidkomponenten. Die gesammelten Daten liefern essentielle Informationen über den molekularen Aufbau von Weizenstroh-Lignin und dienen auf diese Weise als Basis für das Design zukünftiger Experimente zu seiner Anwendung unter Berücksichtigung seiner strukturellen Charakteristika.

Lignin of monocot grasses like wheat is a highly heterogenic macromolecule participating in an elaborated cell wall network compound in planta where it is strongly cross-linked with cell wall polysaccharides. The combination of different isolation methods which target different levels of plant cell wall organization, namely conventional isolation protocols aiming specifically for lignin on one side and recently developed isolation techniques for lignin-carbohydrate-complexes on the other, provides useful data for constructing an enhanced picture of wheat straw lignin variation and its organization inside the plant cell wall. In this thesis wheat straw lignin was isolated using two different approaches: the first as a novel combination of established lignin isolation techniques comprised of an initial ball-milling step, followed by one neutral and eventually one acidolysis-assisted dioxane-water extraction. This approach provided four distinct lignin fractions recovering in total 82% of the starting material, based on Klason lignin (KL): "Free Lignin", accessible by neutral dioxane-water extraction without prior ball-milling, is of very low molar mass, linked to glucan, contains high amounts of p-hydroxycinnamic acids and tricin, and accounted for 14% of KL. "Dioxane Lignin" was isolated after 8 hours of vibratory ball-milling with neutral dioxane-water representing 18% of KL. It is connected to linear arabinoxylan and its monomeric composition indicated its origin from the middle lamella. The biggest fraction (38% of KL), "Acidolysis Lignin", was isolated by acidolysis-assisted dioxane-water extraction of the residual straw after "Dioxane Lignin" isolation. It is connected to branched arabinoxylan and was assigned to the secondary wall based on high ratios of syringyl and p-coumaric acid units. The fourth fraction contained the core glucan-associated lignin in the residual wheat straw that was resistant to all applied extraction methods (12% of KL). In the second isolation approach targeting a higher level of plant cell wall organization, a fractionation protocol for wood and pulp into lignin-carbohydrate complexes (LCCs) was successfully applied to wheat straw recovering 95% of the straw in two LCC fractions, denominated as "Glucan-Lignin" and "Xylan-Lignin". While in the first LCC fraction the lignin moiety was mainly connected to glucan and only small parts to branched arabinoxylan, lignin in the second fraction was linked to linear arabinoxylan and contained a high proportion of ferulic acid. "Glucan-Lignin" was related to secondary wall regions and "Xylan-Lignin" instead to middle lamella regions, based on literature reports about monolignol deposition during lignifications and the monomeric compositions of the lignin inside the LCC fractions determined by 2D NMR spectroscopy. In a third study Dioxane lignin was subjected to preparative molar mass fractionation and fractions of higher molar mass were found to be enriched in p-hydroxyphenyl and p-hydroxycinnamic acid units and associated with linear arabinoxylan. However, in the lower molar mass fractions guaiacyl and syringyl units were more abundant. One fraction showed a high ratio of dibenzodioxocin bonds, ferulic acid and almost exclusively arabinoxylan in the carbohydrates part while carboxylic OH groups were low suggesting their involvement in structural motifs cross-linking lignin with hemicelluloses. Tricin was detected exclusively in lower mass lignin where also additional glucan contributions were found. These results confirm the presence of earlier described "Free Lignin" inside the "Dioxane Lignin" preparation which was characterized as a low mass glucan-associated lignin with high abundance of guaiacyl units and tricin. In the presented studies several wheat straw lignin fractions were isolated and thoroughly characterized showing significant variation in their molecular structure and their specific association to certain polysaccharides providing essential information and orientation for designing respective lignin utilization strategies. The described protocols provide straight-forward routes for accessing lignin fractions that exhibit less heterogeneous structures compared to bulk wheat straw lignin in order to utilize their specific structural characteristics for future wheat straw lignin application and upgrading attempts.