Mass spectrometry of pharmacologically active glycoconjugates from Crocus sativus L.

Abstract

Crocus sativus L. ist eine der teuersten Gewürzpflanzen der Welt, besser bekannt unter dem Namen "Safran". Es wird seit tausenden von Jahren nicht nur als Gewürz und Lebensmittelfarbstoff, sondern auch für verschiedene volksmedizinische Zwecke verwendet. Vor allem die getrockneten Safran-Stigmas, die Crocine enthalten und die für die Farbe verantwortlich sind, werden als potenzielle pharmakologische Wirkstoffe gesehen und wurden strukturell mit LC-ESI-MSn (n=1-3) analysiert. Frühere Studien zeigten, dass Crocinesterglykoside eine oder zwei Glykosylierungsseiten haben können, mit insgesamt bis zu fünf Glucoseeinheiten, aber nur bis zu drei Glucoseeinheiten pro Glykosylierungsstelle. Um Crocinesterglykoside weiter zu untersuchen, wurde eine Umkehrphasen-HPLC mit ESI MS gekoppelt. Für eine optimale Trennung wurde eine Methode mit einem langen Gradienten mit Wasser/Methanol als mobile Phase entwickelt. Die Zugabe von Ameisensäure zur mobilen Phase war notwendig, um bessere LC-Peakformen zu bekommen, insbesondere bei jenen Peaks, die von den Verbindungen stammen, die eine freie Carbonsäure-Gruppe enthalten. Während umfangreicher LC-MS2 und -MS3 Experimente wurde eine Vielzahl (> 10) der bisher nicht beschriebenen neuen Crocinesterglykoside gefunden, sowie eine zweite Art von Apocarotenoid Aglycon (mit C17- Grundkörper, das wir "Norcrocetin" gennant haben im Gegensatz zum bekannten C20 Apocarotenoid Aglycon Crocetin) und hochglykosylierte monosubstituierte Crocetinesterglykoside mit bis zu 11 Glucose-Einheiten. Mehrere andere gering vorkommende Crocine mit bereits bekannten Molekülmassen, die aber nicht beschriebenen Crocin Isomeren zuzuordnen sind, wurden auch gefunden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde versucht, Crocine an der Oberfläche der SafranßStigmas zu lokalisieren. Zu diesem Zweck wurde MALDI Imaging Massenspektrometrie verwendet. Sie liefert die räumliche Verteilung der Analyten auf der gewünschten Oberfläche. Versuche mit zwei verschiedenen Matrices , DHB (2,5-dihydroxy benzoic acid) and THAP (2,4,6-trihydroxyacetophenone). Die besten Ergebnisse wurden mit der DHB-Matrix erreicht. Die Position der Crocinglykoside war unterschiedlich für jedes untersuchte Stigma und aus diesem Grund konnte keine allgemeine Aussage über die Lokalisation der Crocine getroffen werden. Um zu sehen, ob Veränderungen auf der Oberfläche der Safranfäden passieren, wenn diese beiden Matrizen angewendet wurden und wie sich die Lagerung von Safranfäden unter Vakuum, vor der Matrix Aplikation, auf die Matrixverteilung auf der Oberfläche auswirkt, wurden EM-Experimente durchgeführt. Wegen der unebenen Oberfläche der Safranfäden war es nicht möglich mit hilfe von EM, zum Entschluss zu kommen, dass die bessere/schlechtere Verteilung der Matrix das Ergebnis ist, wie die Safranfäden vor der Matrix auftragung gelagert wurden.

Crocus sativus L. is one of the most expensive spice plants in the world, better known under the name -saffron-. It has been used for thousands of years not only as a spice and food colorant, but also for various folk medical purposes. Especially the dried saffron stigmas, which contain crocins being responsible for its color and acting as potential pharmacological active compounds, were structurally analyzed by LC-ESI-MSn (n=1-3). Previous studies showed that crocins constitute ester glycosides with one and two glycosylation sites, respectively, containing up to five glucose units in total, but only up to three glucose units per site. In order to further investigate crocin ester glycosides reverse-phase HPLC was coupled to ESI MS. For optimum separation a method with a long gradient with water/methanol as mobile phase was developed. The addition of formic acid to the mobile phase was necessary in order to get improved LC peak shapes, especially for those peaks related to compounds exhibiting one free carboxylic acid group. During extensive LC-MS2 and -MS3 experiments a large number (> 10) of previously undescribed new crocin ester glycosides was found including a second type of apocarotenoid aglycon (a C17 backbone, which we termed "norcrocetin" in contrast to the known C20 apocarotenoid aglycon crocetin) as well as highly glycosylated monosubstituted crocetin ester glycosides with up to 11 glucose units. Several other low abundant crocins with already known molecular mass, but representing non-described crocin isomers, were found, too. In the second part of this thesis, an attempt to locate crocins on the surface of saffron stigmas was made. For this purpose MALDI imaging mass spectrometry was used. It delivers spatial distribution of the analytes on the desired surface. Experiments with two different matrices, DHB (2,5-dihydroxy benzoic acid) and THAP (2,4,6-trihydroxyacetophenone) were performed. Best results were obtained using the DHB matrix but the location of crocin glycosides was different from stigma to stigma and because of this a general fixed location of crocins could not be determined. For the determination of any specific changes of the matrix distribution on the surface of saffron stigmas when these two matrices were applied prior to/after storage under vacuum conditions, EM experiments were performed. Because of the uneven surface of the saffron stigmas it was not possible to conclude that better/worse distribution of the matrix was the result of the way the stigmas were stored before the matrix was applied.