Aufbau eines Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops

Abstract

Die Fluoreszenzmikroskopie hat sich in den letzten Jahren zu einem wichtigen Werkzeug in Medizin, Biologie und Materialwissenschaften entwickelt. Bei der Fluoreszenzmikroskopie handelt es sich um optische Mikroskopie, welche eine beugungsbedingte Auflösungsgrenze von etwa 250 nm erreicht. Durch Markierung von Proben mit Fluorophoren ist es möglich, sonst kontrastarme Strukturen gut sichtbar zu machen. Es wurden zudem verschiedene Verfahren entwickelt um die beugungsbedingte Auflösungsgrenze zu unterschreiten. Dadurch lassen sich nun Strukturen mit einer Genauigkeit von bis zu 20 nm auflösen. Ein im Rahmen dieser Diplomarbeit näher betrachtetes Verfahren ist PALM bzw. STORM, welches sich der Möglichkeit der präzisen Lokalisation von einzelnen Fluorophoren bedient. Die Arbeit führt, unter Berücksichtigung der wesentlichen Parameter, Schritt für Schritt durch den Aufbau eines Einzelmolekülfluoreszenzmikroskops. Unter Bezugnahme auf die Literatur sowie aufgrund von Daten durchgeführter Messungen werden einzelne Elemente eines Mikroskops zur Einzelmolekülmessung detailliert besprochen. Die Beschreibung des prinzipiellen Aufbaus startet anhand der optimalen Pixelgröße, mit der die Probe abgebildet werden soll. Aus der Wahl der optischen Komponenten folgen die benötigten Größen für die Anregung der Fluorophore. Zudem wird die Aufbereitung der Anregung veranschaulicht und die Bereinigung der Wellenlänge mittels Bandpassfilter sowie die Herstellung eines gaußschen Strahlprofils unter Verwendung von Spatialfiltern bzw. polarisationserhaltenden optischen Fasern erklärt. Letztlich wird das Aufweiten des Laserstrahls auf den gewünschten Durchmesser und dessen Einkopplung in das Mikroskop ausgeführt. Bei der Einkopplung wird außerdem die Möglichkeit von TIRF als Technik zur Verbesserung der Signalqualität erläutert. Nach diesem prinzipiellen Exkurs werden die Komponenten des kommerziellen ImageSystems von TILL-Photonics GmbH vorgestellt und die erarbeitete Justierung bis zur Kopplung mit einem Zeiss-Mikroskop präsentiert. Das nachfolgende Kapitel widmet sich den Toptica Lasern, deren Eigenschaften sowie deren rasche Inbetriebnahme. Die Kamera Andor iXon Ultra 897 wird als entscheidende Komponente zur Detektion ausführlich behandelt. Die wesentlichen Eigenschaften der Kamera werden vorgestellt und der Zusammenhang mit der Bildqualität erklärt. Anhand von Messreihen wird durch Analyse des Signal-Rausch-Verhältnisses die optimale Konfiguration der Kamera für Einzelmolekülmessungen ermittelt und mit den Herstellerempfehlungen verglichen. Nachstehend wird die Implementierung von Kameraoptionen in bestehende Software beschrieben. Abschließend wird auf die Messung der Stabilität des Fluoreszenzmikroskops SDT 1 eingegangen. Zur Bestimmung der Stabilität wurden immobilisierte Beads gemessen und deren Position ausgewertet. Durch Ermittlung der Standardabweichung sowie unter Zuhilfenahme von Fourier-Analyse, Histogramm, Mobilitätsanalyse und ermittelter Korrelationen wird das Verhalten sowie die Stabilität des Setups diskutiert. Zuletzt wird die Qualität verschiedener Fitprogramme untersucht. Die Analyse ergab keine spezifischen Störquellen. Die Messungen erreichen eine Positionsgenauigkeit von etwa 12 nm.

Fluorescence microscopy has evolved to an important tool in medicine, biology and material science. It is an optical microscopy method with a diffraction-limited resolution of about 250 nm. By marking samples with fluorophores, it is possible to make low-contrast structures visible. Various methods have been developed to break the diffraction limit, therefore it is now possible to ressolve structures with an accuracy of down to 20 nm. The method, considered closely in this thesis, is PALM/STORM, which uses the possibility of precise localization of individual fluorophores. This work describes the essential parameters and leads, step by step, through the construction of a single-molecule fluorescence microscope. The particular elements of the microscope for a single molecule measurement are discussed in detail, with reference to the literature as well as the data of the performed measurements. The description of the basic construction starts with referring to the optimal pixel size, at which the sample should be imaged. Based on the choice of the optical components, I delineate the required parameters for the excitation of the fluorophores. In addition, cleaning up the laser is explained with respect to the wavelength through clean-up filters as well as the Gaussian beam profile by using spatial filters or polarization-maintaining optical fibers. Finally, the expansion of the laser beam to the desired diameter as well as the coupling into the microscope is described. As part of the coupling process the possibilities for TIRF as a technique for improving the signal quality is explained. Next the principal components of the commercial imaging system of TILL-Photonics GmbH are introduced and the developed calibrations are explained. The following chapter is dedicated to the Toptica lasers, their properties and their quick implementation. The camera Andor iXon Ultra 897 is discussed in detail as a critical component of detection. The essential characteristics of the camera are presented and their inluence on the image quality is explained. Based on measurements of the signal-to-noise ratio the optimum configuration of the camera is determined with respect to the single-molecule measurements and then compared with the manufacturer's recommendations. Afterwards the implementation of the camera options in the existing software is described. Finally the measurement of the stability of the fluorescence microscope SDT 1 is analyzed. To investigate the stability, immobilized beads were measured and their positions were determined. By calculating the standard deviation and examination via Fourier analysis, histogram, mobility analysis and determined correlations, the behavior and stability of the setup is discussed. In addition, different fit programs are compared. The analysis revealed no specific sources of disturbance. The measurements reach a positional accuracy of approximately 12 nm.