Synchrotron micro X-ray fluorescence imaging of trace elements in articular cartilage and bone in health and disease

Abstract

Bei der Analyse von entnommenen Gewebeproben lebender Organismen mit hochempfindlichen Messmethoden können Elemente in sehr geringen Mengen (ppm) nachgewiesen werden. Diese sogenannten Spurenelemente können für den Organismus essentiell, unwichtig oder sogar schädlich sein. Jedoch ist die Rolle, welche die zahlreichen Spurenelemente in unterschiedlichen Geweben kaum bekannt. Eines dieser Spurenelemente ist das toxische Element Blei (Pb). Die Exposition gegenüber Pb wird mit unterschiedlichen chronischen Erkrankungen des Nerven-, Blutbildendensystems, des Skelettes und der Nieren assoziiert. Etwa 95 % des Pb im menschlichen Körper ist im Skelett gespeichert. Andere Spurenelemente, die im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel von Knochen wichtig sind, sind Zink (Zn) und Strontium (Sr). Zn ist ein wesentlicher Bestandteil vieler Enzyme und an der Knochenresorption beteiligt. Sr ist seit mehreren Jahren als Wirkstoff zur Behandlung von postmenopausaler Osteoporose (pmpOP) in Form von Strontiumranelat (SrR) zugelassen. Knochen ist ein inhomogener anisotroper organisch-mineralischer Verbundwerkstoff, der sich aus grundlegenden strukturellen Einheiten (BSUs) - z. B. Knochenpakete und Osteone -, getrennt durch die sogenannten Zementlinien, zusammensetzt. Knochengewebe wird ständig umgebaut und Krankheiten wie pmpOP verändern diesen Umbauprozess. Es war ein Ziel, herauszufinden, ob der veränderte Knochenstoffwechsel in pmpOP die Verteilung und Menge von Zn, Sr und Pb im Knochen beeinflusst. Weiters war von Interesse ob es einen Zusammenhang zwischen der Zn, Sr und Pb Verteilung und der Struktur vom Knochen gibt. Analysiert wurden humane Knochenproben von Patienten mit einem osteoporotischen Schenkelhalsbruch und gesunde Kontrollen mit Synchrotronstrahlungs induzierter Mikro-Röntgenfluoreszenzanalyse (SR µ-XRF). Es konnte gezeigt werden, dass die Verteilung und Menge von Zn, Sr und Pb stark mit der Knochenstruktur korreliert ist. Die Zementlinien wiesen eine signifikante Ansammlung von Zn und Pb, im Vergleich zum Benachbarten Knochen auf, und in den BSUs zeigten Sr und Pb einen überproportionalen Anstieg mit dem Ca-Gehalt des Knochens. Durch den veränderten Knochenstoffwechsel bei pmpOP scheint es allerdings nicht zu signifikanten Veränderungen auf der Ebene der Spurenelemente (Verteilung und Menge) zu kommen. In früheren Studien konnte eine Ansammlung von Zn und Pb in der Grenzschicht zwischen mineralisiertem und nicht mineralisiertem Gelenksknorpel - der sogenannte Tidemark (TM) - entdeckt werde. Da sich der Gelenksknorpel und der Knochen in ihrer chemischen Zusammensetzung grundlegend unterscheiden, könnte spekuliert werden, dass Pb in diesen beiden Geweben unterschiedliche gebunden ist. In Proben von Patienten ohne bekannte Knochenkrankheiten wurden mittels Röntgen Absorptions-Spektrometrie (XAS) der chemische Bindungszustand von Pb untersucht. Es stellte sich heraus, dass Pb sowohl in der TM als auch im Knochen an kohlenstoffhaltiger Kalziumhydroxyapatit gebunden ist. SrR ist seit mehreren Jahren zur Behandlung von pmpOP zugelassen. In verschiedenen Tier-und Humanstudien wurde die frakturhemmende Wirkung bewiesen. Dennoch sind die Auswirkungen der Ernährung, im speziellen der Ca-Gehalt, auf die Sr Aufnahme in den Knochen unklar. Weiters ist die Verteilung des im trabekulären Knochen eingebauten Sr nicht gut dokumentiert. Um diese Fragen zu beantworten, wurden Knochenproben eines Tierversuches mit Ratten mit SR µ-XRF untersucht. In diesem Tierversuch wurde die Ca Aufnahme (normal und niedrig) und die Verwendung von verschiedenen Sr Wirkstoffen (SrR und SrCl2) getestet. Es konnte gezeigt werden, dass Sr überwiegend in, während der Behandlung gebildetem, neuem Knochengewebe akkumuliert wird. Die Ca Aufnahme stellte sich als wesentlicher Faktor für die Sr Akkumulation im Knochen heraus. Zu niedrige Ca Aufnahme führte zu deutlich erhöhten Sr Werten im Knochen. Der SrR Wirkstoff hat in allen Fällen zu einer höheren Sr Menge im Knochen geführt als das SrCl2. Die SR µ-XRF Experimente wurden an der ANKA FLUO Beamline mit in konfokalen Aufbau aus zwei Polykapillaren (Auflösung 12 µm x 12 µm) ausgeführt. Die XAS Messungen in der XANES Region wurden an der ANKA SULX Beamline gemacht. Die histologischen Eigenschaften der inspizierten Knochenareale wurden mittels quantitativer Rasterelektronenmikroskopie (qBEI) bestimmt. Da Strahlzeit an Synchrotrons begrenzt, und schwer zu bekommen ist, wurde ein konfokales µ-XRF System mit einer Niederleistungsröntgenröhre (50W) im Labor getestet, um zu sehen, ob es zum Prescreening für künftige SR µ-XRF Studien benutzt werden kann. Die SR µ-XRF Ergebnisse des Rattentierversuches wurden mit Messungen der gleichen Proben im Labor verglichen. Trotz der weniger optimalen Messbedingungen im Labor wurden die gleichen signifikanten Unterschiede für die verschiedenen Behandlungsgruppen gefunden. Das Laborsystem eignet sich offenbar als leicht zugängliches Prescreening-Werkzeug für künftige SR µ-XRF Messungen.

Analyzing tissue of living beings using highly sensitive methods, elements in very minute quantities (ppm) can be found. These so called trace elements can be essential and / or non-essential for the living organism. However, the role of many trace elements in tissues e.g. bone is poorly understood. One of these trace elements is the toxic element lead (Pb). Exposure to it is associated with chronic diseases in the nervous, hematopoietic, skeletal, renal and endocrine system. About 95 % of the total human body burden of Pb are present in the skeleton. Other trace elements important in the context of bone metabolism and mineralization are zinc (Zn) and strontium (Sr). Zn is an essential part of several enzymes involved in bone remodelling and since several years Sr is approved as therapeutic agent for postmenopausal osteoporosis (pmpOP) in the form of Strontium Ranelate (SrR). Bone tissue is an inhomogeneous anisotropic organic mineral composite material made up of basic structural units (BSUs) -e.g. bone packets and osteons - separated by the so called cement lines. Bone tissue is continuously remodelled and diseases like pmpOP drastically alter this remodelling process. It was an aim to find out if the altered bone metabolism in pmpOP influences the distribution and the levels of Zn, Sr and Pb in bone. Further it was of interest to see if the microscopic structure of bone (bone packets,osteons, cement lines) is linked to the localization and the levels of these trace elements. Analyzing osteoporotic fractured and non-fractured human bone samples with synchrotron radiation induced micro X-Ray fluorescence analysis (SR µ-XRF) it could be shown that the distribution and amounts of Zn, Sr and Pb are strongly correlated with the structural units of bone. The cement lines presented significant accumulations of Zn and Pb compared to adjacent bone, and in the BSUs Sr and Pb were found to have a strong over proportional correlation with the calcium (Ca) content. However, the altered bone metabolism in pmpOP turned out to have not significant influence on the trace element levels or distribution. In previous studies an accumulation of Zn and Pb at the interface between mineralized and non-mineralized articular cartilage - the so called tidemark (TM) - was discovered. As the chemical environment in the articular cartilage is completely different from bone tissue it could be speculated that the chemical binding of Pb different in the TM and in bone. Human joint samples with no known bone disease were examined using X-Ray absorption spectrometry (XAS) to clarify this issue. It turned out that Pb found in the TM and bone is present in the same chemical compound, carbonated calcium hydroxyapatite. Since several years SrR is an approved therapeutic agent for pmpOP. In various animal and human studies the anti-fracture effect of SrR was documented. However the impact of the nutritional Ca intake - and thus the Ca serum levels - on the Sr uptake into bone was unclear. Additionally, the localisation of the incorporated Sr in trabecular bone was not well documented. In order to address these issues bone samples from a rat animal model were investigated applying SR µ-XRF. This animal model was simulation the different nutritional Ca intake (normal and deficient) and the use of different Sr drugs (SrR and SrCl2). It could be shown that the Sr is predominantly accumulated in the bone tissue formed during the treatment. The nutritional Ca intake turned out to have a tremendous impact on the Sr incorporation into bone. Deficient Ca intake lead to distinctly elevated Sr levels in bone. The SrR drugs lead to slightly higher Sr incorporation in all cases compared to SrCl2. The SR µ-XRF experiments were carried out at the ANKA FLUO beamline using a confocal setup with two polycapillary half lenses (lateral resolution ~12 µm x 12 µm). The XAS analysis in the XANES region, to elucidate the speciation of Pb in bone and TM, were carried out at the ANKA SUL-X beamline (Karlsruhe, Germany) offering a spot size on the sample in the range of 20 µm to 200 µm. The histological properties and the morphology of the inspected bone areas were determined using quantitative backscattered electron imaging (qBEI). As beamtime at synchrotron facilities is limited and not easy to obtain a laboratory based confocal µ-XRF system, issued with a low power X-Ray tube (50 W) was tested to see if the laboratory µ-XRF setup can be used as pre-screening tool for future SR µ-XRF studies. Results from the rat animal model obtained with SR µ-XRF were compared to measurements of the same samples in the laboratory. Despite the inferior measurement conditions in the laboratory compared to the synchrotron, the same significant differences that were found for the different treatment groups. The idea of using the laboratory system as easy accessible pre-screening tool for synchrotron studies is therefore reasonable.