Constructing FRET biosensors for intracellular metabolite detection via fluorescence microscopy

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte ein FRET Biosensor zur Quantifizierung von C4 Dicarboxylaten (wie bereits publiziert [1]) konstruiert werden. Ziel war es, den Sensor für Aspergillus niger verwendbar zu machen. Die Linker des Biosensors wurden daher adaptiert, um mit dem Funbrick System (Laura van der Straat) kompatibel zu sein. Zwei verschiedene Versionen des Sensors mit derselben Bindungsdomäne und unterschiedlichen FRET-Paaren sollten konstruiert werden, um C4-Dicarboxylate wie Malat, Fumarat, Succinat und Oxalacetat in zwei verschiedenen Zellkompartimenten, dem Cytosol und den Mitochondrien, zu beobachten. Nach Prüfung und Charakterisierung des Sensors sollte A. niger mit dem Konstrukt transformiert werden. Ein FRET Biosensor mit dem FRET-Paar GFP-mCherry wurde in E. coli rekonstruiert, aufgereinigt und mit Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Die Analyse des Sensors im zellfreien Extrakt mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine Änderung der Intensität der Emission von GFP (und damit eine Änderung des FRET-Verhältnisses) bei Substratzugabe, was zeigt, dass der Sensor funktioniert. Ein C4 Bindungsdomäne-YFP Fragment und ein CFP-Rückgrat Fragment für die Konstruktion des zweiten Biosensors wurden gebaut. Eine GFP-Variante mit einer neuen Kombination an Mutationen (F64L, S65T, Y66W und T203Y) ("Frog") wurde hergestellt. Weiters wurde eine neue, schnelle optische Screeningmethode für Transformanten mit GFP und CFP entwickelt, und ein Klonierungstool, um Kolonie-PCR zu umgehen, wird vorgestellt. Wird A. niger mit dem vorliegenden FRET Biosensor transformiert, so könnte dies der erste FRET Biosensor für die Anwendung in diesem Pilz sein und wichtige neue Erkenntnisse über dessen Stoffwechselwege erschließen. Eine weiterführende Charakterisierung des Biosensors wird empfohlen.

Background The determination of intracellular metabolites is an important aspect of metabolic engineering, especially also in combination with metabolic modelling approaches. Quantifying a large number of intracellular metabolites via rapid sampling methods is currently very challenging and prevents the observation of specific metabolites of interest in real-time. Förster resonance energy transfer (FRET) biosensors present an interesting and powerful tool to determine biologically important ligands. As protein based biosensors, they are able to interact with other molecules, inducing a conformational change of the biosensor which can be linked to optical detection methods. So called FRET pairs rely on the transfer of fluorescent energy between two fluorophores, therefore indicating the distance of the FRET pair. If binding of the ligand induces a conformational change of this biosensor, the distance of the FRET pair located on the sensor will change, resulting in a change in transfer of fluorescent energy. This allows relative quantification of the metabolite of interest. Aim The aim of this project is to reconstruct FRET biosensors for C4-dicarboxylates (as previously published) with the internally developed FunbrickTM system (Laura van der Straat). Furthermore, additional biosensors of selected intracellular metabolites of interest can be developed in the course of this project. Approach FunbrickTM compatible biosensors containing suitable FRET pairs will be constructed and used to transform different strains of Aspergillus niger. The transformants will be analyzed via fluorescence microscopy and hypotheses of the cellular location and/or pathways taken by the analyzed metabolites will be formed. Methods Several lab techniques are used in this project. Molecular cloning techniques, Aspergillus niger transformation, Genomic DNA isolation and PCR, Fluorescence microscopy