Investigating the NADH enzyme library of the extremophile Methanothermobacter marburgensis as a potential tool for synthetic biology

Abstract

Synthetische Biologie umfasst Gebiete wie die Expression rekombinanter Proteine, der Anwendung synthetisch hergestellter Aminosäuren bis hin zur Integration von ganzen Stoffwechselwegen in fremde Organismen. Ziel dieser Forschungsgruppen ist es, die Eigenschaften bestimmter Organismen zu verändern, um deren Produktivität zu steigern oder die Qualität der gewonnen Produkte zu erhöhen.<br />Eingriffe dieser Art in den Wirtsorganismus führen zu erhöhtem Energiebedarf, der durch Erhöhung der respiratorischen Kapazität adaptiert werden kann. Das Enzyme NADH Dehydrogenase ist Enzym der Atmungskette und somit beteiligt an der ATP-Synthese. Eine weitere Funktion des Enzymes ist die Regenerierung von NADH. Unter gestressten Bedingungen, wie Substratüberschuss, kommt es zur Akkumulation von NADH, welche das Umschalten des Stoffwechsels in aerobe Fermentation bewirkt.<br />Nebenprodukte der Fermentation hemmen die Ausbeute der eigentlichen Produkte, daher wird versucht, diese zu verhindern.<br />Aus dem Genom von Methanothermobacter marburgensis wurden 3 Gene extrahiert und auf NADH-Dehydrogenase Aktivität getestet. Alle 3 Gene (9703839, 9703840 und 9704440) konnten erfolgreich mit His-Tag in E.<br />coli BL21DE3 transformiert werden. Das Protein 9704440 konnte in ausreichender Menge überexprimiert werden, um nach erfolgreicher Reinigung mittels Affinitätschromatographie kinetisch untersucht zu werden. NADH Dehydrogenase-Aktivität konnte mit unterschiedlichen Elektronenakzeptoren und NADH als Elektronendonator nachgewiesen werden.<br />Ein VIS-Spektrum wurde aufgenommen und es konnte das Vorhandensein eines Flavins als nicht kovalent gebundene prothetische Gruppe konnte nachgewiesen werden. Diese Fakten ließen den Schluss zu, dass das Genom des anaeroben Methanothermobacter marburgensis Gene für das Enzym NADH Dehydrogenase enthält. Das pH Optimum des Enzymes wurde mit 8.0 ermittelt, und ist nicht stabil bei Temperaturen über 60 °C.<br />