Deep multi-epitope imaging of the bone marrow disseminated disease in neuroblastoma

Abstract

Das Neuroblastom (NB) ist ein extrakranialer solider Tumor und die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Kindern unter einem Jahr. NB Patienten mit metastasierter Erkrankung (Stadium M) weisen häufiger Rezidive auf und haben niedrige Überlebensraten. Bei der Mehrheit der Stadium M Patienten werden disseminierte Tumorzellen (DTZ) im Knochenmark (KM) gefunden. Desweiteren, ist das KM auch der Ort, an dem Immunzellen gebildet werden. Diese können sowohl einen fördernden, als auch inhibierenden Effekt auf das Wachstum von Tumorzellen und somit wahrscheinlich auch auf DTZ haben. Umgekehrt, können DTZ auch Immunund andere Zelltypen im Knochenmark beeinflussen. Momentan werden DTZ im KM mithilfe von Immunfluoreszenz (IF)-Färbung und automatisierter Bildgebung detektiert und quantifiziert, um den Therapieerfolg zu beurteilen. Diese Methode erlaubt jedoch eine Detektion von lediglich bis zu drei Antigenen (Biomarkern). Neue Bildgebungsmethoden werden nun entwickelt, um die gleichzeitige IF-Färbung von mehreren Antigenen zu ermöglichen und somit unser Verständis über die Kommunikation zwischen DTZ und Immunzellen in KM zu verbessern. Das Ziel dieser Arbeit ist es, neue Biomarker zu finden, um DTZ und die Immunzellen im KM zu charakterisieren. Diese Biomarker sollen zuerst einzeln validiert und anschließend mit der multi-dimensionalen Bildgebungsmethode, Multi-Epitope Ligand Cartography (MELC), dargestellt werden. Die, mittels MELC generierten, multi dimensionalen Bilder sollen anschließend anhand von maschinellen Lernverfahren analysiert werden. Zunächst wurden RNA Sequenzierungs Datensätze von Stadium M Patienten (Tumoren, DTZ, KM-isolierte nicht Tumorzellen) und Proteom-Datensätze (NB Tumoren, Zelllinien, Fibroblasten) analysiert und, unter Einbeziehung öffentlicher Datenbanken, gefiltert und so relevante Biomarker ausgewählt. Anschließend wurden Protokolle für die Probenvorbereitung von Knochenmarksaspiraten sowie für die IF-Färbung der gefundenen Biomarker optimiert und somit an die technischen Anforderungen der MELC Umgebung angepasst. Die mit MELC produzierten Bilder wurden anschließend prozessiert und segmentiert, um so die Berechnung von Einzell-Features zu ermöglichen. Um die zelluläre Zusammensetzung einer Patientenprobe zu untersuchen, wurden diese Features, unter Verwendung von Methoden der Dimensionalitätsreduktion, im zweidimensionalen Raum dargestellt.

Neuroblastoma (NB), an extracranial solid tumor, is the most common cancer diagnosed in children in their first year of life. Disseminated tumor cells (DTCs) in the bone marrow (BM) are detected in the majority of stage M (metastatic) NB patients who have a high risk of relapse and low survival rates. Cells of the immune system develop in the BM and can either have an inhibitory or promoting effect on tumor progression and thus most likely on DTCs. In turn, DTCs may affect immune and other cell types in the BM. Currently, automatic immunofluorescence (IF) imaging is state-of-the-art to evaluate treatment response and identify DTCs in the BM, however this method allows visualization of only up to three biomarkers. Novel imaging techniques now enable simultaneous or sequential staining of multiple targets, which could improve our understanding of the cross-talk between DTCs and the local immune response in the BM microenvironment. Thus, the aim was to identify as well as validate additional relevant biomarkers, visualize these by multi-dimensional imaging and thereby characterize DTCs and the metastatic BM microenvironment using machine-learning based methods. Based on data mining of RNA-sequencing (seq) data-sets of stage M NB (tumors, DTCs, BM-derived non-tumor cells) and proteomics data (NB tumors, cell lines, fibroblasts), and guided by public databases, relevant biomarkers were selected. Sample preparation and IF-staining protocol were optimized to validate specificity of identified biomarkers and allow the assessment of protein expression profiles by multi-epitope ligand cartography (MELC). Single-cell morphological and fluorescence features were computed and validated on processed and segmented MELC images to be further used for exploration of distinct cell populations by dimensionality reduction based methods. Herein, three novel potential DTC biomarkers are proposed, namely DCLK1, FAIM2 and TAG1, which give new insight into NB heterogeneity. By addition and validation of further biomarkers to characterize the cell composition in the BM microenvironment and potential therapeutic targets, three individual 23 biomarker IF-panels are provided. Based on machine learning methods, the qualification of computed features as single-cell descriptors is proven and the latter are employed for visualization of distinct cell populations by stochastic neighbor embedding approaches. Obtained results demonstrate proof-of-principle for the assessment of cell composition in the metastatic BM microenvironment and will help to refine diagnostics for stage M NB patients. Dadurch konnten drei potentielle DTZ Biomarker (DCLK1, FAIM2 und TAG1) gefunden werden, welche neue Einblicke in die Tumorheterogenität von Neuroblastomen geben. Außerdem, wurden drei, aus 23 Biomarkern bestehende, IF-Panele zusammengestellt. Diese Panele ermöglichen die Erkennung potentieller, therapeutischer Angriffsmoleküle auf der Oberfläche von DTZ und die Charakterisierung von Immunzellen in der KM Mikroumgebung. Darüber hinaus, konnte die Eignung der entwickelten Features für die Beschreibung von Einzelzellen, mittels maschineller Lernvefahren, gezeigt werden. Diese Validierung erlaubt die anschließende Verwendung der Features für die Analyse von verschiedenen Zellpopulationen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zelluläre Zusammensetzung der metastatischen KM Mikroumgebung mit den, hier beschriebenen, Methoden untersucht werden kann. Diese Entwicklung hilft somit zukünftig die Diagnose von Stadium M Patienten zu verfeinern.