Dominant selection markers and novel inducible promoters for Trichoderma reesei

Abstract

Trichoderma reesei ist ein wichtiger industrieller Zellulase- und Hemizellulaseproduzent. In der Vergangenheit wurde die Stammverbesserung hauptsächlich durch konventionelle Mutations- und Selektionsmethoden erreicht, um die Produktion von Zellulasen und anderer Proteine zu verbessern. Daneben werden heute auch häufig gentechnischen Methoden verwendet, wobei die dafür nötigen molekularen Werkzeuge noch weiterentwickelt werden müssen. Dazu gehört die Identifikation neuer Promotoren für induzierbare rekombinante Expression von Proteinen und neuer Selektionsmarker für genetische Transformationen. Die Anforderungen an das induzierbare Expressionssystem waren, dass die induzierende Substanz nicht mit dem Wachstum des Pilzes oder seiner Zellulaseproduktion interferiert. Frühere Studien identifizierten das Vitamin Pantothensäure als eine potentiell induzierbare Substanz, welches diese Kriterien erfüllt. Mithilfe einer genomweiten Transkriptomanalyse wurden durch Pantothensäure regulierbare Gene in einer auf Weizenstroh basierender T. reesei Kultur identifiziert. Eine Analyse der Microarray Ergebnisse identifizierte fünf Gene welche einen starken Anstieg der Transkriptlevels nach Zugabe der Pantothensäure zeigten. Das Expressionsprofil dieser fünf Gene wurde per RT-qPCR quantifiziert. Die Expression von allen fünf Genen war 2.5 Stunden nach Induktion mit 1 mM Pantothensäure am höchsten. Die Analyse der Gene zeigte weiters, dass diese in T. reesei co-lokalisiert vorliegen. Der Gencluster enthält außer den identifizierten Genen zusätzlich noch einen Transkriptionsfaktor und ist auch in anderen Trichoderma Arten vorhanden. Eines der Gene im neu identifizierten Gencluster ist ein Ortholog von LIZ1, eine Pantothenatpermease aus Schizosaccharomyces pombe. Die anderen 4 Gene kodieren möglicherweise für Enzyme des Pantothensäurekatabolismus. Um die Einsetzbarkeit der identifizierten Gene für induzierbare Genexpression zu demonstrieren, wurde ein Reporterkonstrukt entwickelt. Dieses enthält die Promoterregion eines der Pantothenssäure induzierbaren Gene, die kodierenden Region des gfp Gens (grün fluoreszierendes Protein) als Reporter mit dem Terminator des Histon 3 Gens und der Hygromycin Expressionskassette als Selektionsmarker. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden dominante Selektionssysteme für die Transformation des Zellulase Hyperproduzenten RUT-C30 evaluiert. Das Hyphenwachstum und die Regenerationsfähigkeit der Protoplasten wurden mit den antimykotischen Substanzen Glyphosat, Nourseothricin, Geneticin und Glufosinat getestet. Vier Expressionskassetten, die die Resistenz zu diesen Substanzen verleihen, wurden durch Transformation als dominante Selektionsmarker überprüft. Die Transformation ergab stabile RUT-C30 Stämme, welche resistent gegen Nourseothricin, Geneticin und Glufosinat waren. Glyphosat resistente Stämme wurden nicht erhalten. Die Transformationseffizienz der drei Marker war mit der häufig verwendeten Hygromycin B Resistenz Expressionskassette vergleichbar. Eine einzelne Kopie der Markerkassetten führte schon zur Resistenz. Die getesteten Marker können nun für die genetische Manipulation von industriell relevanten T. reesei Stämmen eingesetzt werden.

Trichoderma reesei is an important industrial organism for cellulase and hemicellulase production. In the past strain improvement relied mainly on conventional mutation- and selection methods to improve the production of cellulases and other proteins. Although genetic engineering is used for strain breeding, the molecular tools for efficient strain engineering need to be further advanced including the identification of novel promoters for inducible recombinant expression of proteins and of new selection markers for genetic transformation. A prerequisite for the inducible expression system was that the inducing substance does not interfere with enzyme production. Preliminary studies identified the vitamin pantothenic acid as a potential neutral inducer with respect to cellulase production and fungal growth. To identify pantothenic inducible genes the genome-wide response of the addition of pantothenic acid to a wheat straw culture was investigated by a microarray approach. Microarray analysis identified five genes which showed a strong transcriptional upregulation during growth on wheat-straw as carbon source following the addition of pantothenic acid. The expression profile of these five genes was further quantified by RT-qPCR. Expression of all five genes was highest after 2.5 hours of induction using 1 mM pantothenic acid. Analysis of the five genes showed that they are co-located in the T. reesei genome sequence. These five genes form together with an additional putative transcription factor a gene cluster which is also conserved in other Trichoderma spp.. Analysis of the five genes and their corresponding proteins shows that one of the genes encodes an orthologue to LIZ1 a pantothenate permease of Schizosaccharomyces pombe. The other four genes encode probably enzymes involved in pantothenic acid catabolism. To demonstrate the applicability of the identified genes for inducible gene expression, an expression vector was constructed. It contains the promoter region of one of the pantothenic inducible genes, the coding region of the gfp gene (green fluorescence protein) as reporter followed by the terminator region of the histone 3 gene and the hygromycin expression cassette as selection marker. In the second part of this work four new dominant selection systems were tested for the transformation of the cellulase hyperproducer RUT-C30. Hyphal growth and protoplast regeneration were tested for their susceptibility to different antifungal agents including glyphosate, nourseothricin, geneticin or glufosinate. Four expression cassettes which confer resistance to these substances were tested as dominant selectable markers in transformations. Transformation resulted in stable RUT-C30 transformants resistant against nourseothricin, geneticin or glufosinate. No glyphosate resistant strains were obtained. The efficiency of transformation for the three markers was comparable to a frequently used hygromycin B resistance conferring cassette and already single copies of the three marker cassettes led to resistance. The tested markers will allow multiple genetic manipulations in industrially applied T. reesei strains.