Evaluation of the E. coli effector EspG and its role in inflammatory bowel disease

Abstract

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) zeichnen sich durch Entzündungen des gastrointestinalen (GI) Traktes aus. Die zwei häufigsten CED sind Morbus Crohn (MC) und Colitis Ulcerosa. (CU) CED breiten sich in den letzten Jahrzehnten immer schneller aus und mittlerweile sind über 3.6 Millionen Menschen davon betroffen. Die Pathogenese von CEDs beinhaltet drei Faktoren: genetische Suszeptibilität, Umweltfaktoren und das Mikrobiom des GI-Traktes. Es wurde gezeigt, dass das Effektorprotein EspG, welches in pathogenen Enterobacteriacea-Spezies vorkommt, humane p21-aktivierte Kinasen (PAKs) binden und aktivieren kann. PAKs aktivieren proinflammatorische Signalkaskaden und sind in CED sowohl überexprimiert als auch aktiviert. Die zugrunde liegenden biochemischen Ursachen verbleiben jedoch unklar. Das Ziel dieser Diplomarbeit war es die Inzidenz von EspG und in CED Patienten zu evaluieren. Die Untersuchung von DNS aus Stuhlproben (152 CU, 210 MC, 100 Kontrollen) mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) ergab, dass 20 % der CED Patienten detektierbare Mengen von EspG in ihrem Stuhl haben, im Vergleich zu 10 % in der Kontrollgruppe. Das Vorhandensein von EspG ist mit entzündlichen Prozessen assoziiert, da der Median der EspG-positiven CU Proben mit 468 mg/kg deutlich über dem EspG-negativer Proben (155 mg/kg) liegt. Neun aus dreizehn CED-Patienten zeigen eine Assoziation von EspG mit Spitzen in Calprotektin-Werten im longitudinalen Verlauf. Quantitative PCR Analysen ergaben, dass eine metagenomische Rekonstruktion der EspG-tragenden Bakteriengenome in 11 MC Proben möglich ist. Das Vorhandensein der EspG-tragenden bakteriellen Pathogenitätsinsel wurde bei ausgewählten Proben weiters mittels Multiplex-PCR bestätigt. Des Weiteren wurde beim Sequenzieren der EspG-PCR-Produkte bisher unbeschriebene DNS Codes entdeckt, was auf unbekannte bakterielle Spezies hinweist. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine Assoziation von EspG mit CED und weisen damit in Richtung eines neuen biochemischen Weges, welcher für die Entwicklung personalisierte Behandlungen genutzt werden könnte.

Inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic diseases with inflammation of the gastrointestinal tract and comprise ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD).The pathogenesis of IBD involves three major, intertwined denominators: genetic susceptibility, environmental factors and the gut microbiota. The pathogenic Enterobacteriacea effector protein EspG has been shown to bind and activate human p21-activated kinases (PAK). PAKs drive proinflammatory pathways and are overexpressed and activated in IBD, although the underlying biological processes are not understood. The aim of this thesis was to evaluate the incidence of EspG in IBD patients. Polymerase chain reaction (PCR) screening of DNA extracted out of stool samples (152 UC, 210 CD, 100 controls) revealed that 20 % of IBD patients have traceable amounts of EspG in their feces compared to 10 % in the control group. EspG positivity is associated with inflammation, as median calprotectin value of EspG-positive UC patients was more than three times as high (468 mg/kg) than in the EspG-negative UC population (155 mg/kg). Longitudinal analysis revealed that 9 out of 13 IBD-patients displayed a distinct association of EspG-positivity with spikes in calprotectin-values. Quantitative PCR suggested metagenomic reconstruction of the EspG-carrying bacterial genomes being feasible in 11 CD-samples. Presence of the bacterial EspG-carrying pathogenicity islands was further confirmed with a multiplex-PCR in selected samples. Sequencing of EspG-PCR amplifications hints to undescribed bacterial species being involved in these observations. Taken together these results validate an association of EspG with IBD, thereby pointing in the direction of a novel pathway that can be harnessed for personalized treatment.