Novel High Speed - AFM probes for imaging of biological samples in liquid environments

Abstract

Videos are the most comprehensive method to illustrate dynamic processes. Yet, the only method which is capable to directly image the dynamic processes of biological molecules is High-Speed Atomic Force Microscopy (HS-AFM). Other techniques cannot reach the same high resolution or only use indirect processes, which are then correlated to the molecular dynamics. HS-AFM is an advanced form of AFM, a method to create high resolution topographic images of almost any material. An excited mechanical resonator is interacting with the surface atoms of the sample, causing changes in its oscillation behaviour. Shifts in e.g. resonance frequency can be measured for each spot of the sample, composing an image of its surface. With HS-AFM, high resolution images can be obtained in a millisecond timescale. Repeated rapidly, a movie of the successive images can be generated. This allows to study single molecular processes that happen in very short time frames. As the imaging can also happen in a liquid, also biological samples and even living samples can be studied. This gives an insight of structures, functions and dynamics of biological molecules. Complex processes that can be directly visualized in a movie, which facilitate their understanding and allows a straight forward study. Many questions on the dynamics and behaviour of biomolecules have been answered using HS-AFM. However, even more questions could be answered if the imaging speed is increased, hence many processes happen within even sub-millisecond time intervals. Even faster imaging is desired by scientists, but is difficult to achieve. For standard mechanical resonators a high oscillation frequency, necessary for rapid scans, is directly linked to a high spring constant, which will destroy especially biological samples, thus making a fast scan speed impossible. To overcome the physical limits of standard cantilever designs, a new geometry, a coupled cantilever system, is presented in this thesis. With this novel cantilever even higher frequencies and therefore image rates can be reached, especially in liquids. After the introduction of the HS-AFM method, the mathematical background of the system is explained, as well as the fabrication of the first proto type and first experiments. Ultimately the first images taken in a HS-AFM setup are presented.

Filmsequenzen werden oftmals genutzt, um dynamische Prozesse anschaulich zu präsentieren. Bis heute gibt es nur eine einzige Methode, die eine direkte Aufnahme von dynamischen biologischen Prozessen ermöglicht. Diese heißt High-Speed Atomic Force Microscopy (HS-AFM). Andere Mikroskopie-Verfahren erreichen dafür entweder nicht die benötigte Auflösung oder sie können die Vorgänge nur indirekt aufnehmen, also über andere Effekte, die dann auf die eigentlichen Prozesse zurückschließen lassen. HS-AFM ist eine weiterentwickelte Form von AFM, einem Verfahren, bei dem hochauflösende Aufnahmen der Topografie einer Probe gemacht werden. Dabei interagiert ein angeregter, mechanischer Resonator mit den Oberflächenatomen der Probe und verändert dabei seine Schwingungseigenschaften. Diese Änderungen der z.B. Resonanzfrequenz werden an jedem Punkt der Probe gemessen und ergeben so ein Bild der Oberfläche. Mit HS-AFM werden Bilder innerhalb von Millisekunden aufgenommen. Wird dies mehrmals wiederholt, können die so entstandenen Bilder zu einem Film zusammengesetzt werden. Somit können Prozesse von einzelnen Molekülen, die davor nicht zeitlich auflösbar waren,bildlich dargestellt werden. Da auch in Flüssigkeiten eine Aufnahme möglich ist, können auch biologische Proben und sogar lebende Proben untersucht werden. Dies erlaubt einen Einblick in die Struktur, Funktionsweisen und Dynamiken von Biomolekülen. Viele Fragestellungen bezüglich der Funktionsweise von Biomolekülen konnten mit Hilfe von HS-AFM geklärt werden. Allerdings warten noch viele, unbeantwortete Fragen, die mit einer erhöhten Aufnahmegeschwindigkeit geklärt werden könnten, denn viele Prozesse spielen sich in noch kürzeren Zeitskalen, im Sub-Millisekundenbereich, ab. Daher besteht bei vielen Forschern der Wunsch nach noch schnelleren AFM-Systemen, jedoch sind die Anforderungen technisch nicht so leicht zu verwirklichen. Bei typischen, balkenartigen Resonatoren gibt es einen physikalischen Zusammenhang zwischen einer höheren Resonanzfrequenz, die für eine schnellere Bildgebung notwendig ist, und einer höheren Federkonstante, die möglicherweise die Zerstörung insbesondere von biologischen Proben zur Folge hätte. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein neuer, gekoppelter Resonator entwickelt. Mit diesem neuen Cantileverdesign können höhere Frequenzen und daher eine höhere Bildrate erreicht werden ohne die Probe zu zerstören, vor allem in Flüssigkeiten. Die Herstellung und die ersten Messungen werden nun in dieser Arbeit vorgestellt.